王虹玲，吳 優(yōu)，于子簫，康振宇，趙奕彭，康宗利*

（1.沈陽工學院 生命工程學院，遼寧 撫順 113122；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學 生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110866；3.西南科技大學 生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010）

釀酒葡萄皮渣中含有大量與葡萄酒類似的生物活性物質，尤以多酚類化合物為主（如白藜蘆醇、原花青素、酒石酸等），這些物質都具有較強的抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗衰老等生物活性，已成為世界性的重要營養(yǎng)兼藥用的商品[1-5]。白藜蘆醇是含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，主要存在于葡萄屬、花生屬等植物中，以虎杖、葡萄中含量最多，而在葡萄中又以葡萄皮中的含量最高[6-10]。

目前，白藜蘆醇提取常見的方法有有機溶劑提取法、超聲波提取法、微波輔助法、酶解法等。由于自然界中白藜蘆醇的含量較低，通常在提取前需要對提取對象進行生物轉化，如將樣本中的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇多聚體衍生物通過酸堿水解或酶解轉化為白藜蘆醇，可大大提高白藜蘆醇提取率[11-12]。

本研究以自釀葡萄酒發(fā)酵后的皮渣為原材料，將皮渣干燥后磨粉過篩，利用纖維素酶解法在不同條件下進行白藜蘆醇的提取，并對提取得到的白藜蘆醇進行抗氧化及體外抗腫瘤活性分析，以期為葡萄皮渣資源的利用以及白藜蘆醇產(chǎn)品的深度開發(fā)奠定理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒葡萄皮渣：康美爾葡萄經(jīng)葡萄酒發(fā)酵后濾出清液所得。人宮頸癌Hela細胞、人肺癌A549細胞、人前列腺癌PC-3細胞：均由中國醫(yī)科大學提供。

白藜蘆醇標準品（色譜純），纖維素酶（酶活105U/g）、鄰二氮菲、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、1,1-二苯基-2-硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硝酸鋁、乙酸乙酯（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

RE-201D型旋轉蒸發(fā)儀：予華儀器有限公司；W200IR型CO2培養(yǎng)箱：美國SIM公司；TS-100倒置顯微鏡：日本Nikon公司；Stat Fax-3200酶標儀：美國AWARENESS公司；1-15K高速冷凍離心機：德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點

操作要點：

釀酒葡萄皮渣粉末：新鮮釀酒葡萄皮渣經(jīng)紗布過濾去除殘余水分后，50℃烘干至質量恒定，經(jīng)粉碎機粉碎，過40目篩，得到的皮渣粉，末加入石油醚進行脫脂處理；旋轉蒸發(fā)去除石油醚，得到的葡萄皮渣粉末裝入密封容器內(nèi)備用。

纖維素酶解：準確稱取釀酒葡萄皮渣粉末1.0g于100mL燒杯中，加入一定量的蒸餾水和纖維素酶在50℃、pH 5.0條件下酶解1 h。

體積分數(shù)95%乙醇浸提：酶解后加入一定量體積分數(shù)95%的乙醇，浸提一段時間后離心去除濾渣。

白藜蘆醇粗提液：濾液經(jīng)旋轉蒸發(fā)去除乙醇，得到白藜蘆醇粗提液。

白藜蘆醇浸膏：白藜蘆醇粗提液中加入乙酸乙酯，反復萃取3次，合并乙酸乙酯相，旋轉蒸發(fā)去除乙酸乙酯，得到白藜蘆醇浸膏。

目標產(chǎn)物：白藜蘆醇浸膏于50℃條件下烘干至質量恒定，進行含量測定。

1.3.2 白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的單因素試驗

以釀酒葡萄皮渣為原料，分別以纖維素酶添加量（30U/μL、50U/μL、70U/μL、90U/μL、110U/μL、130U/μL）、體積分數(shù)為95%乙醇與葡萄皮渣液固比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1（mL∶g））、酶解時間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）、酶解溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60℃、70℃、80℃）為評價因素，白藜蘆醇提取率為評價指標，進行釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取的單因素試驗。

1.3.3 白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，根據(jù)中心組合設計（central composite design，CCD）的設計原理，利用Design Expert 8.0.6.1軟件進行響應面設計，以酶添加量（A）、液固比（B）、酶解時間（C）、酶解溫度（D）為考察因素，以釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率（Y）為評價指標優(yōu)化酶解條件。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 釀酒葡萄皮渣酶解條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for wine grape pomace hydrolysis conditions optimization

1.3.4 測定方法

白藜蘆醇含量：參照文獻[13]的方法進行測定；

DPPH自由基清除能力：以維生素C（vitamin C，VC）作為對照，參照文獻[14]的方法進行測定；

超氧陰離子自由基清除能力：以VC作為對照，參照文獻[15]的方法進行測定；

體外抗腫瘤活性：參照文獻[16]的方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的單因素試驗結果

2.1.1 酶添加量對釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

圖1 纖維素酶添加量對白藜蘆醇提取率的影響Fig.1 Effect of cellulase addition on the extraction rate of resveratrol

由圖1可知，白藜蘆醇提取率隨酶添加量的增加呈現(xiàn)先升高后平穩(wěn)的趨勢；當酶的添加量為70 U/μL時，白藜蘆醇提取率達到最高，為142.82 μg/g。繼續(xù)增加酶添加量，葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率并沒有明顯提高。表明此時溶液中酶的添加量已近于飽和。因此，選擇酶添加量為70 U/μL進行后續(xù)試驗。

2.1.2 液固比對釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

由圖2可知，白藜蘆醇提取率隨液固比的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；當液固比為25∶1（mL∶g）時，白藜蘆醇提取率達到最高，為139.82 μg/g。繼續(xù)增加液固比，反應體系中酶的濃度逐漸稀釋，降低了酶解作用效果，導致白藜蘆醇提取率逐漸降低。因此選擇液固比為25∶1（mL∶g）。

圖2 液固比對白藜蘆醇提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of resveratrol

2.1.3 酶解時間對釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

圖3 酶解時間對白藜蘆醇提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the extraction rate of resveratrol

由圖3可知，白藜蘆醇提取率隨酶解時間的延長呈現(xiàn)先升高后平穩(wěn)的趨勢；當酶解時間為90 min時，白藜蘆醇提取率達到最高，為142.48 μg/g。繼續(xù)增加酶解時間，葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率并沒有明顯提高。此時，細胞壁已基本被破壞，再延長酶解時間對試驗效果影響不顯著（P＞0.05）。因此選擇酶解時間為90 min。

2.1.4 酶解溫度對釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

圖4 酶解溫度對白藜蘆醇提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of resveratrol

由圖4可知，白藜蘆醇提取率隨酶解溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；當酶解溫度為50℃時，白藜蘆醇提取率達到最高，為129.63 μg/g。當酶解溫度＞50℃時，酶的活性受到嚴重影響，高溫破壞了酶的結構，影響了酶對細胞壁的分解作用，抑制了白藜蘆醇的提取。因此，選擇酶解溫度為50℃。

2.2 響應面分析法優(yōu)化葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取工藝

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

響應面試驗結果與方差分析分別見表2和表3。

表2 釀酒葡萄皮渣酶解條件優(yōu)化響應面分析試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for wine grape pomace hydrolysis conditions optimization

從表3可以看出，回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），模型調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.9193，R2=0.9583，表明該模型與試驗擬合較好，可以用于葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的預測。從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，各試驗因素對白藜蘆醇提取率的影響為A＞B＞C＞D，交互項除AD外其余各項均極顯著（P＜0.01），二次項除C2外均極顯著（P＜0.01）。模型所預測的最優(yōu)提取條件為酶添加量70.16 U/μL，酶解時間148.43 min，酶解溫度39.80 ℃，液固比18.16∶1（mL∶g），在此條件下，白藜蘆醇的提取量為141.48 μg/g。

表3 回歸模型的方差分析結果Table 3 Variance analysis results of regression model

對各試驗點的響應值進行多元回歸擬合，得到回歸模型方程為：Y=139.46+5.76A-4.91B+1.20C-0.78D+3.98AB+4.13AC+2.01AD+-9.84BC-4.98BD-5.46CD-5.36A2-3.99B2-1.29C2+2.48D2

2.2.2 交互作用分析

釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的響應面及等高線圖如圖5所示。

由圖5可知，酶添加量和液固比的交互作用對白藜蘆醇的提取量影響極顯著（P＜0.01）；在一定的液固比條件下，提取量隨酶添加量的增大呈先增大后減小的趨勢。酶添加量和酶解時間的交互作用對白藜蘆醇的提取量影響極顯著（P＜0.01）；在不同的酶解時間下，提取量隨酶添加量的升高而逐漸降低。固液比和酶解溫度的交互作用對白藜蘆醇的提取量影響極顯著（P＜0.01）；在一定酶解溫度條件下，提取量隨液固比的增大呈先增大后減小的趨勢。酶解時間和酶解溫度的交互作用對白藜蘆醇的提取量影響極顯著（P＜0.01）；在一定的酶解溫度下，提取量隨酶解時間的增大呈逐漸減少的趨勢。液固比和酶解時間的交互作用對白藜蘆醇的提取量影響極顯著（P＜0.01）；在不同的液固比條件下，提取量隨酶解時間的增大而逐漸減少。

圖5 酶添加量、酶解時間、酶解溫度、液固比交互作用對釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇含量影響的響應曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between cellulase addition,enzymolysis time,temperature and solid-liquid ratio on resveratrol content from wine grape pomace

2.2.3 最佳提取條件驗證試驗

根據(jù)響應面優(yōu)化得到的結果，結合實際試驗操作，將考察因素設定為酶添加量為70 U/μL，酶解時間為150 min，酶解溫度為40 ℃，液固比為20∶1（mL∶g），重復3次試驗，得到葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率為144.13 μg/g，與模型預測值141.48 μg/g接近，證實了模型的有效性。

2.3 葡萄皮渣中白藜蘆醇的抗氧化活性分析

由圖6A可知，VC和白藜蘆醇均對DPPH自由基有較強的清除效果，且清除率隨抗氧化劑濃度的增加而呈上升趨勢。其中VC在試驗范圍內(nèi)對DPPH自由基的清除效果優(yōu)于白藜蘆醇，當質量濃度為1.2 mg/mL時，VC的清除率可達（88.03±2.251）%，白藜蘆醇的清除率為（65.12±3.882）%。

圖6 不同質量濃度的VC及白藜蘆醇對DPPH（A）和超氧陰離子（B）自由基的清除效果Fig.6 Scavenging capacities of different concentrations of VC and resveratrol on DPPH free(A)and superoxide anion(B)free radicals

由圖6B可知，不同濃度的白藜蘆醇均具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力，并隨質量濃度的不斷增大，清除率逐漸升高，當質量濃度為1.2mg/mL時白藜蘆醇對超氧陰離子自由基的清除率達到最大，為（54.13±3.105）%，陽性對照VC對超氧陰離子自由基的最大清除率為（86.58±2.975）%。白藜蘆醇對超氧陰離子自由基的抗氧化性雖不及VC，但也表現(xiàn)出一定的清除效果。

2.4 葡萄皮渣中白藜蘆醇的體外抗腫瘤活性分析

采用MTT法測定葡萄皮渣中白藜蘆醇對3種癌細胞Hela、A549和PC-3的體外抑制活性，并根據(jù)抑制率計算半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）值，結果見表4。

表4 白藜蘆醇對3種腫瘤細胞株的IC50值Table 4 IC50value of the three tumor cell strains treated with resveratrol

由表4可知，白藜蘆醇對前列腺癌PC-3細胞的抑制最為顯著，IC50值最小，為25.31 μmol/L；對Hela細胞和A549細胞的IC50值分別為128.29 μmol/L和108.35 μmol/L。

3 結論

本研究采用纖維素酶水解法對釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取工藝進行優(yōu)化，確定最優(yōu)提取條件為酶添加量70 U/μL，酶解時間150 min，酶解溫度40 ℃，液固比20∶1（mL∶g），重復3次試驗，得到葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率為144.13 μg/g。

抗氧化試驗結果顯示，釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇對DPPH自由基和超氧陰離子自由基均具有較好的清除作用，在試驗濃度范圍內(nèi)，清除率隨濃度的增加而升高。當樣品質量濃度為1.2 mg/mL時，對DPPH和超氧陰離子自由基的清除率達到（65.12±3.882）%和（54.13±3.105）%，表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。

體外抗腫瘤試驗結果表明，釀酒葡萄皮渣中的白藜蘆醇對Hela、A549和PC-3細胞的增長具有抑制作用，其IC50值分別為128.29μmol/L、108.35 μmol/L和25.31 μmol/L，表現(xiàn)出一定的體外抗腫瘤活性。