張玉玉 蘇文政 馬建軍 黃保華 蔣慧 吳家強(qiáng) 王可

摘要：為研究保加利亞乳桿菌（LB）N-乙酰胞壁質(zhì)酶（Mur）的分子生物學(xué)特性，根據(jù)已發(fā)表的保加利亞乳桿菌核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增LB MN株不含跨膜區(qū)域序列的mur基因，片段回收后克隆至pMD19-T載體并進(jìn)行鑒定，再將其亞克隆于原核表達(dá)載體pET-30a（+）中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a（+）-mur，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。SDS-PAGE和Western blot分析顯示重組Mur蛋白分子量約為21 kD，能在大腸桿菌中高效表達(dá)。

關(guān)鍵詞：保加利亞乳桿菌；N-乙酰胞壁質(zhì)酶；原核表達(dá)；鑒定

中圖分類號(hào)：S879.1：TS252.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）05-0014-04

Abstract In order to study the molecular properties of the N-acetylmuramidase from Lactobacillus bulgaricus， a pair of special primers were designed and synthesized according to the nucleotide sequence of LB mur gene in GenBank. The mur gene without transmembrane sequence was amplified from the genome DNA of LB MN strain and cloned into pMD19-T vector. The gene was sequenced and cloned into the prokaryotic expression vector pET-30a（+）. The recombinant plasmid pET-30a（+）-mur was transformed into competent BL21（DE3） and the expression of the recombinant protein was induced with IPTG. The SDS-PAGE and Western blot showed the molecular weight of the recombinant protein mur was approximately 21 kD and its expression was efficient in Escherichia coli.

Keywords Lactobacillus bulgaricus； N-acetylmuramidase； Prokaryotic expression； Identification

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，LB）是一種被冠以國(guó)姓的乳酸菌，由保加利亞微生物學(xué)家Stamen Grigorov在1905年發(fā)現(xiàn)并命名。該菌是可用于保健食品的益生菌菌種之一，具有維持微生態(tài)平衡和胃腸道健康、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收、增強(qiáng)免疫功能及抗癌抗腫瘤等重要生理功能[1，2]。該菌是酸乳發(fā)酵劑中的常用菌種，也是酸乳發(fā)生后酸化的主要菌株[3]。

有研究表明酸乳貨架期菌體自溶影響酸乳的后酸化程度和品質(zhì)，高自溶活性的保加利亞乳桿菌菌株在酸乳發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸性能更優(yōu)，酸乳后酸化的程度相對(duì)較低[4，5]。而在酸乳發(fā)酵劑生產(chǎn)中，保加利亞乳桿菌菌體自溶不利于菌株的高密度培養(yǎng)。菌體自溶與肽聚糖水解酶降解菌體細(xì)胞壁的作用息息相關(guān)。Pang等報(bào)道保加利亞乳桿菌N-乙酰胞壁質(zhì)酶（N-acetylmuramidase，mur）基因敲除時(shí)菌體自溶活性顯著降低，該基因過(guò)表達(dá)時(shí)菌體自溶活性顯著升高，表明Mur在保加利亞乳桿菌菌體自溶中起著非常重要的作用[6]。本研究構(gòu)建了保加利亞乳桿菌mur基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)研究，并應(yīng)用SDS-PAGE和Western bolt對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行了鑒定，為后續(xù)深入研究Mur的自溶活性及開展保加利亞乳桿菌自溶活性的改造研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株和載體

保加利亞乳桿菌MN株，由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。原核表達(dá)載體pET-30a（+），本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T克隆載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

Dream Taq DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；His標(biāo)簽鼠的單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠二抗為Sigma公司產(chǎn)品；His Bind Purification Kit為美國(guó)Novagen公司產(chǎn)品。

1.3 引物合成

根據(jù)GenBank中保加利亞乳桿菌ATCC 11842（NC_008054.1）基因組序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)mur基因的特異引物，由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。上游引物：mur-F：5′-GTCATATGCACCATCATCATCATCATCGCCGCCAGGCCTTGC-3′，下游引物：mur-R：5′-CGCAAGCTTTTAATTATCGTACTTATTCAGGTTGTATTGTTC-3′，上下游引物5′端分別引入NdeⅠ和Hind Ⅲ兩個(gè)酶切位點(diǎn)（下劃線處），上游引物5′端還引入了His標(biāo)簽（斜體處）。該引物擴(kuò)增截掉跨膜區(qū)序列的mur基因，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為573 bp。

1.4 目的基因克隆

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取保加利亞乳桿菌MN株的基因組DNA作為PCR模板，擴(kuò)增保加利亞乳桿菌mur基因。PCR反應(yīng)體系：10×buffer 5 μL，dNTPs（2 mmol/L）5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，模板DNA 2 μL，Dream Taq DNA Polymerase 0.25 μL，加無(wú)菌水至50 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸40 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目的片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR鑒定，將陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 原核表達(dá)載體pET-30a（+）-mur的構(gòu)建及鑒定

分別用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切含目的基因的pMD19-T和pET-30a（+）質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的基因和pET-30a（+）線性片段，連接后轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，將陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取含重組質(zhì)粒pET-30a（+）-mur的BL21（DE3）單克隆接種于含卡那霉素（Kan）的LB液體培養(yǎng)基上，37℃振蕩培養(yǎng)（200 r/min）過(guò)夜。取過(guò)夜的菌液按1%接種至新鮮的含Kan的LB液體培養(yǎng)基上，37℃振蕩培養(yǎng)2～3 h，至菌液OD600值達(dá)0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h。分別取誘導(dǎo)前后的菌液離心收集菌體，用PBS（pH值7.4）重懸菌體，加入等量的2×SDS凝膠上樣緩沖液，混勻后于沸水中煮10 min，進(jìn)行SDS-PAGE（5%濃縮膠，12%分離膠）。

1.7 重組蛋白的Western blot 分析

誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；轉(zhuǎn)印好的PVDF膜用5%脫脂奶粉TBST溶液室溫下封閉2 h；TBST漂洗后用His標(biāo)簽鼠的單克隆抗體室溫?fù)u床孵育1 h；漂洗后再加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠抗體室溫?fù)u床孵育1 h，最后以DAB顯色，觀察條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增與鑒定

以保加利亞乳桿菌MN株基因組DNA為模板，成功擴(kuò)增了不含跨膜區(qū)序列的mur基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)573 bp的擴(kuò)增片段，與預(yù)期目的基因的片段大小相符（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增出的目的基因片段與GenBank上公布的mur基因序列（NC_008054.1）的同源性為99.8%。

2.2 原核表達(dá)載體pET-30a（+）-mur的鑒定

挑取PCR鑒定的pET-30a（+）-mur陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，分別用NdeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切質(zhì)粒，pET-30a（+）質(zhì)粒片段大小約為5 300 bp，mur基因的大小約為570 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。測(cè)序結(jié)果顯示序列完全正確。

2.3 SDS-PAGE檢測(cè)

將鑒定陽(yáng)性的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a （+）-mur轉(zhuǎn)化BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDS-PAGE，表達(dá)產(chǎn)物重組Mur蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為21 kD（圖3）。

2.4 Western blot檢測(cè)

用His標(biāo)簽鼠的單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果如圖4所示，在硝酸纖維素膜上約21 kD處出現(xiàn)特異性條帶。

3 討論與結(jié)論

乳酸菌自溶現(xiàn)象是菌體在脅迫環(huán)境下維持生存的一種自我保護(hù)行為，大量研究表明肽聚糖水解酶（PGHs）在菌體自溶中發(fā)揮著重要作用[7-9]。PGHs按照其作用位點(diǎn)的差異主要分為5類：Mur、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、內(nèi)肽酶和羧肽酶[10]。不同乳酸菌中所含有的關(guān)鍵PGHs種類存在差異，干酪乳桿菌ATCC 27092和植物乳桿菌WCFS1的關(guān)鍵PGHs是N-乙酰氨基葡萄糖苷酶[11，12]，而保加利亞乳桿菌LJJ的關(guān)鍵PGHs是Mur[6]。

保加利亞乳桿菌Mur可水解肽聚糖N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸間的β-1，4糖苷鍵，將N-乙酰胞壁酸的還原基團(tuán)解離出來(lái)[13]。前期試驗(yàn)我們構(gòu)建了完整mur基因的原核表達(dá)載體，但I(xiàn)PTG誘導(dǎo)后Mur蛋白幾乎不表達(dá)。利用SignalP 3.0和TMpred在線軟件分析Mur蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)Mur蛋白的5′端存在跨膜區(qū)域，因此本研究運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增了截掉跨膜區(qū)序列的mur基因，成功建立了不含跨膜區(qū)序列的mur基因的原核表達(dá)系統(tǒng)。SDS-PAGE和Western blot分析顯示重組Mur蛋白能在大腸桿菌中高效表達(dá)。重組mur基因原核表達(dá)系統(tǒng)的建立為進(jìn)一步研究Mur蛋白的分子生物學(xué)特性及開展保加利亞乳桿菌自溶活性的改造研究奠定了基礎(chǔ)。

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