梁嘉穎 鄭毅春 李子濤 汪李虎 劉風(fēng)華

廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科（廣州510010）

準(zhǔn)確的精液分析是診斷男性不育癥的第一步，目前常用的標(biāo)準(zhǔn)是世界衛(wèi)生組織2010年發(fā)布的《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊第5版》（簡稱WHO第5版）［1］，其中精子總數(shù)、前向運(yùn)動（progressive motility，PR）精子百分率和正常形態(tài)精子百分率是評價(jià)精子質(zhì)量的重要依據(jù)。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會《臨床診療指南輔助生殖技術(shù)與精子庫分冊》［2］，治療輕、中度男性不育癥首選的輔助生殖技術(shù)（ART）是宮腔內(nèi)人工授精（intrauterine insemination，IUI），而合并女方不孕因素、重度少、弱、畸精子癥及無精子癥等，則可進(jìn)行體外授精（in vitrofertilization，IVF）或卵泡漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治療。但影響ART成功率的因素很多，包括女方因素、用藥方案［3-4］、授精時(shí)機(jī)［5］、手術(shù)次數(shù)［6］、周期數(shù)［7］和男方精液因素［8-9］如優(yōu)化處理后的活動精子總數(shù)。大量研究證實(shí)，優(yōu)化處理后的活動精子數(shù)量不足會使ART的臨床妊娠率降低［10］。但目前并未明確限定精液優(yōu)化處理到授精的時(shí)間，且對延長該時(shí)間間隔與精子質(zhì)量參數(shù)的相關(guān)性研究較少，而精子體外獲能時(shí)間是與患者個(gè)體情況無關(guān)的變量，相對于其他影響因素，其可控性較強(qiáng)，因此，根據(jù) WHO第5版［1］和前期研究結(jié)果［11］，本實(shí)驗(yàn)將精子體外獲能時(shí)間分為20、40、80和120 min，主要目的是探討優(yōu)化處理后精液孵育至授精之間最佳的時(shí)間間隔，從而更有效地提高ART成功率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象連續(xù)收集400例（正常精子、少精子癥、弱精子癥和畸形精子癥各100例）于2017年1-12月在廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科就診的男性受試者。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO第5版，精子總數(shù)≥39×106，前向運(yùn)動（PR）精子百分率≥32%，正常形態(tài)精子百分率≥4%為正常精子；精子總數(shù) ＜39×106為少精子癥；PR%＜32%為弱精子癥；正常形態(tài)精子百分率＜4%為畸形精子癥［1］。所有受試者均簽署知情同意書，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。

受試者年齡、精液體積、精子總數(shù)、濃度、總活力（progressive motility+non?progressive motility，PR+NP%）、PR%等數(shù)據(jù)組間差異見表1。

表1 優(yōu)化處理前各組精液標(biāo)本參數(shù)Tab.1 The baseline characteristics of prewash semen samples（n=100） ± s

表1 優(yōu)化處理前各組精液標(biāo)本參數(shù)Tab.1 The baseline characteristics of prewash semen samples（n=100） ± s

精液參數(shù)年齡（歲）精液體積（mL）精子總數(shù)（× 106）精子濃度（106/mL）PR%PR+NP%正常形態(tài)率（%）正常精子32.0±4.1 3.0±0.9 98.0±13.4 58.6±21.7 51.3±11.4 62.6±13.1 4.9±1.2少精子癥31.4±3.9 1.8±0.9 46.8±10.7 17.6±7.1 60.8±12.4 76.8±11.9 5.2±1.1弱精子癥31.7±2.8 2.6±0.9 92.5±14.0 46.2±19.1 25.5±5.3 51.6±10.5 5.0±0.8畸形精子癥30.6±3.1 2.9±0.8 96.8±12.9 40.5±24.3 52.3±12.4 74.8±12.1 2.1±1.1 F值1.27 10.92 16.73 13.58 15.62 16.00 11.37 P值0.206 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

1.1.2 主要儀器與試劑西班牙Microptic公司SCA計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）；日本Olym?pus公司BX53普通光學(xué)顯微鏡；德國Eppendorf公司的移液器；上海齊欣科學(xué)儀器有限公司CU?600電熱恒溫水浴箱；珠海貝索生物技術(shù)有限公司精子（細(xì)胞）形態(tài)學(xué)快速染色液（Diff?Quik法）；瑞典Vitrolife公司SpermGrad梯度液、SpermRinse洗精液、IVF受精培養(yǎng)液等。

1.2 方法

1.2.1 精液采集受檢者禁欲2～7 d，以手淫方式采集精液于潔凈無菌的一次性采精杯中，隨即放置37℃孵育箱20 min。記錄精液采集時(shí)間、精液優(yōu)化處理開始時(shí)間、精液優(yōu)化處理后孵育開始時(shí)間。

1.2.2 精液常規(guī)檢測按照WHO第5版［1］進(jìn)行精液常規(guī)參數(shù)檢驗(yàn)，記錄精液體積，并采用CASA系統(tǒng)分析觀察精子濃度、精子總數(shù)、PR+NP%和PR%。計(jì)算公式：精子總數(shù)=精液體積×精子濃度，PR精子總數(shù)=PR%×精子濃度×精液體積，活動精子總數(shù)=PR+NP%×精子濃度×精液體積。

1.2.3 精子形態(tài)分析采用Diff?Quik染色法［1］，普通光學(xué)顯微鏡下10×100倍油鏡觀察分析200條精子，計(jì)數(shù)頂體區(qū)異常、頭部異常、頸部和中段異常以及尾部異常精子數(shù)，計(jì)算正常形態(tài)精子百分率。

1.2.4 精液優(yōu)化處理采用密度梯度離心法，精液液化20 min后，制備1 mL＋1 mL 95%＋45%的SpermGrad梯度液分層，小心在最上層加入不超過1 mL精液。1 600 r/min離心20 min，吸管吸取最下層沉淀，在5 mL SpermRinse液中混勻，1 600 r/min離心5 min，棄上清，向沉淀中加入0.5 mL IVF培養(yǎng)液，混勻作為授精液，置5%CO2、37℃、95%濕度培養(yǎng)箱；根據(jù)WHO第5版［1］和前期研究結(jié)果［11］，將孵育時(shí)間設(shè)為20、40、80和120 min，記錄每份精液優(yōu)選后及孵育各時(shí)間點(diǎn)的PR+NP%、活動精子總數(shù)、PR%和PR精子總數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多個(gè)樣本組比較采用重復(fù)測量方差分析，兩兩組間比較用q檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常精子組精液優(yōu)化處理后參數(shù)比較根據(jù)表2所示，正常精子組的PR+NP%和活動精子總數(shù)在孵育40 min最高，在120 min最低；PR%和PR精子總數(shù)在20 min最高，在120 min最低；采用多樣本組間方差分析，PR%、PR精子總數(shù)、PR+NP%和活動精子總數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

表2 正常精子精液優(yōu)化處理后孵育不同時(shí)間的精子參數(shù)Tab.2 Postwash semen parameters in different periods in group normozoospermia ±s

表2 正常精子精液優(yōu)化處理后孵育不同時(shí)間的精子參數(shù)Tab.2 Postwash semen parameters in different periods in group normozoospermia ±s

注：與20 min比較，*P ＜0.01；與40 min比較，ΔP ＜0.01

精子參數(shù)精子濃度（106/mL）PR%PR精子總數(shù)（×106）PR+NP%活動精子總數(shù)（×106）0 min 30.3±19.5 92.9±6.2 10.1±5.1 98.0±5.0Δ 11.7±5.8Δ 20 min 30.2±19.5 96.3±5.8 12.3±5.3 98.3±3.7Δ 13.4±4.1Δ 40 min 30.1±19.5 93.8±9.1*9.2±3.6*98.6±2.7 14.4±2.6 80 min 30.3±19.5 90.3±12.2*8.8±2.6*97.4±4.6Δ 11.3±2.6Δ 120 min 30.4±19.6 87.5±10.5*8.1±1.7*93.4±8.3Δ 10.1±5.4Δ F值0.004 13.620 18.160 16.730 15.560 P值1.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 少精子癥組精液優(yōu)化處理后參數(shù)比較根據(jù)表3所示，少精子癥組的PR%、PR精子總數(shù)、PR+NP%和活動精子總數(shù)在20 min最高，在120 min最低；采用多樣本組間方差分析，PR%、PR精子總數(shù)、PR+NP%和活動精子總數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

表3 少精子癥精液優(yōu)化處理后孵育不同時(shí)間的精子參數(shù)Tab.3 Postwash semen parameters in different periods in group oligozoospermia ±s

表3 少精子癥精液優(yōu)化處理后孵育不同時(shí)間的精子參數(shù)Tab.3 Postwash semen parameters in different periods in group oligozoospermia ±s

注：與20 min比較，*P＜0.01

精子參數(shù)精子濃度（106/mL）PR%PR精子總數(shù)（×106）PR+NP%活動精子總數(shù)（×106）0 min 11.0±3.7 90.8±10.0 8.5±3.6 95.8±4.0 10.3±5.7 20 min 11.0±3.6 91.5±9.1 8.6±2.1 96.0±4.3 10.7±4.8 40 min 11.0±3.7 90.3±9.7*8.2±3.3*94.8±3.8*10.3±4.1*80 min 11.0±3.6 81.2±8.6*7.2±3.7*90.0±2.4*9.0±4.8*120 min 11.0±3.7 78.6±9.3*7.1±3.2*87.9±5.3*8.7±5.3*F值0.014 10.310 18.920 13.430 18.000 P值1.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 弱精子癥組精液優(yōu)化處理后參數(shù)比較根據(jù)表4所示，弱精子癥組的PR%、PR精子總數(shù)、PR+NP%和活動精子總數(shù)在20 min最高，在120 min最低；采用多樣本組間方差分析，PR%、PR精子總數(shù)、PR+NP%和活動精子總數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

表4 弱精子癥組精液優(yōu)化處理后孵育不同時(shí)間的精子參數(shù)Tab.4 Postwash semen parameters in different periods in group asthenozoospermia±s

表4 弱精子癥組精液優(yōu)化處理后孵育不同時(shí)間的精子參數(shù)Tab.4 Postwash semen parameters in different periods in group asthenozoospermia±s

注：與20 min比較，*P＜0.01

精子參數(shù)精子濃度（106/mL）PR%PR精子總數(shù)（× 106）PR+NP%活動精子總數(shù)（×106）0 min 20.2±10.1 90.5±5.3 10.0±7.1 95.6±4.5 12.8±6.0 20 min 21.7±10.8 90.8±9.1 10.7±2.1 97.1±4.3 12.9±5.8 40 min 21.3±10.7 85.3±9.7*9.2±8.3*94.3±4.8*11.3±4.7*80 min 20.8±10.9 80.2±11.6*8.2±6.7*90.3±5.4*10.0±4.8*120 min 20.9±10.4 76.6±11.3*7.3±5.2*87.9±10.3*9.4±5.0*F值0.007 10.630 17.240 13.910 17.330 P值1.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 畸形精子癥組精液優(yōu)化處理后參數(shù)比較根據(jù)表5所示，畸形精子癥組的精子總活力和活動精子總數(shù)在孵育40 min最高，在120 min最低，PR%和PR精子總數(shù)在20 min最高，在120 min最低；采用多樣本組間方差分析，PR%、PR精子總數(shù)、PR+NP%和活動精子總數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.5 正常精子組、少精子癥組、弱精子癥組和畸形精子癥組各時(shí)間點(diǎn)精液參數(shù)的比較重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示，優(yōu)選20 min后，正常生育組、少精子癥組、弱精子癥組和畸形精子癥組的各時(shí)間點(diǎn)精液參數(shù)差異均有顯著性（表6）。

2.6 精子獲能時(shí)間與IUI臨床妊娠率的關(guān)系選擇研究時(shí)間段內(nèi)400例男性受試者中，妻子采用來曲唑（LE）促排方案進(jìn)行IUI治療的242個(gè)周期。根據(jù)獲能時(shí)間的不同，分析了4組的臨床妊娠率，分別為13.9%、25.9%、11.8%和0%，40 min組顯著高于其他3組（均P＜0.05，表7）。

表5 畸形精子癥組精液優(yōu)化處理后孵育不同時(shí)間的精子參數(shù)Tab.5 Postwash semen parameters in different periods in group teratozoospermia ±s

表5 畸形精子癥組精液優(yōu)化處理后孵育不同時(shí)間的精子參數(shù)Tab.5 Postwash semen parameters in different periods in group teratozoospermia ±s

注：與20 min比較，*P ＜0.01；與40 min比較，ΔP＜0.01

精子參數(shù)精子濃度（106/mL）PR%PR精子總數(shù)（×106）PR+NP%活動精子總數(shù)（×106）0 min 30.5±14.3 92.3±2.4 13.2±6.3 97.0±1.1Δ 14.6±2.7Δ 20 min 30.7±13.8 93.4±5.1 14.0±7.1 97.1±1.3Δ 14.7±3.8Δ 40 min 30.3±12.1 92.7±4.5*13.2±6.3*98.3±2.8 15.3±4.1 80 min 30.1±10.9 84.2±1.6*11.2±6.7*92.3±6.4Δ 13.0±3.8Δ 120 min 30.0±12.4 78.6±1.3*10.1±7.2*87.9±10.9Δ 12.1±3.3Δ F值0.005 11.31 17.72 13.88 17.25 P值1.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表6 正常精子組、少精子癥組、弱精子癥組和畸形精子癥組各時(shí)間點(diǎn)精液參數(shù)的比較Tab.6 Postwash semen parameters in different periods in all groups

表7 精子獲能時(shí)間與宮腔內(nèi)人工授精臨床妊娠率的關(guān)系Tab.7 Correlation of clinical pregnancy with the incubation time from the end of semen processing to intrauterine insemination±s

表7 精子獲能時(shí)間與宮腔內(nèi)人工授精臨床妊娠率的關(guān)系Tab.7 Correlation of clinical pregnancy with the incubation time from the end of semen processing to intrauterine insemination±s

注：與40 min比較，*P＜0.05

女方年齡（歲）男方年齡（歲）不孕年限（年）臨床妊娠率［例/例（%）］20 min 30.7±1.8 33.4±5.1 3.0±0.1 10/72（13.9）*40 min 30.3±2.1 32.7±4.5 3.2±0.3 29/112（25.9）80 min 30.1±1.9 34.2±1.6 3.2±0.7 6/51（11.8）*120 min 30.0±1.4 33.6±1.3 3.1±0.2 0/7（0.0）*F/χ2值0.005 0.001 0.002 8.165 P值0.946 3.121 1.833 0.043

3 討論

IUI是治療輕度男性不育癥的首選ART，IUI簡單易行，費(fèi)用低廉，不會引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，IVF主要用于治療男方少、弱精子癥及女方存在配子運(yùn)送障礙或排卵障礙等不孕因素的患者，ICSI則是用于嚴(yán)重的少、弱、畸精子癥或無精癥患者的有效治療方法［1-2］。正確的精液采集和優(yōu)化處理是ART中非常重要的環(huán)節(jié)，不正確的精液采集可能因未收集到完整的精液而影響精子質(zhì)量，還可能導(dǎo)致ART治療失敗等嚴(yán)重不良后果；根據(jù)WHO第5版［1］要求，精液標(biāo)本應(yīng)該在靠近實(shí)驗(yàn)室的私密房間采集，精液診斷性分析必須在采集后1 h內(nèi)完成，因?yàn)闃?biāo)本的新鮮度會直接影響妊娠結(jié)局。精液離體后，精子的存活率和活動率會受體外溫度和時(shí)間的變化影響而逐漸下降，新鮮精液標(biāo)本中，精子可以在12 h內(nèi)保持一定的前向運(yùn)動率，并可存活24～48 h。

精液優(yōu)化處理不僅可以去除精漿、不活動精子、畸形精子、細(xì)胞碎片和其他有害物質(zhì)，還可制備含高比例的形態(tài)學(xué)正常的活動精子。因此，在進(jìn)行各種ART治療前，精液標(biāo)本必須進(jìn)行優(yōu)化處理，以獲得最佳功能精子。受精前，精子需孵育一定時(shí)間進(jìn)行獲能，獲能后的精子運(yùn)動活躍、頂體和精膜的流動性明顯增加，具備發(fā)生頂體反應(yīng)、精卵識別和融合的能力［12］，但孵育時(shí)間過長，培養(yǎng)液中的活動精子不斷消耗葡萄糖、果糖等能量，使能量耗盡而無法在IUI手術(shù)或體外受精后到達(dá)準(zhǔn)確的受精部位；男性睪丸精子中阻礙受精的DNA碎片亦會隨獲能時(shí)間的延長而增加［13］；精子在培養(yǎng)液中孵育時(shí)間越長，自發(fā)頂體反應(yīng)率越高，進(jìn)而影響卵子正常受精而降低臨床妊娠率。本研究結(jié)果顯示，弱精子癥組精液在進(jìn)行優(yōu)化處理后，置5%CO2、37℃、95%濕度環(huán)境下孵育20 min，PR%、PR精子總數(shù)、PR+NP%和活動精子總數(shù)均為最高，而正常精子組、少精子癥組和畸形精子癥組的精子質(zhì)量參數(shù)在孵育40 min內(nèi)，不會因孵育時(shí)間的延長而下降，但當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到80～120 min，4組相關(guān)參數(shù)均顯著下降；每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上4組比較結(jié)果為孵育20 min后，正常生育組、少精子癥組、弱精子癥組和畸形精子癥組各精子質(zhì)量參數(shù)均有顯著性差異，提示弱精子癥組精子質(zhì)量可能更易受孵育時(shí)間影響。本研究還提示，獲能時(shí)間在40 min的IUI臨床妊娠率最高，與FAUQUE等［14］研究結(jié)果相似，該研究認(rèn)為，優(yōu)化處理后的精液在37℃孵育40～80 min能獲得最適宜的IUI臨床妊娠率。YAVAS等［15］則發(fā)現(xiàn)，精液采集后30 min內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化處理比31～60 min組妊娠率顯著提高，精液采集后90 min內(nèi)進(jìn)行IUI比91～120 min組或＞120 min組妊娠率顯著升高。各研究得出的具體孵育時(shí)間雖不盡相同，可能是由于采用了不同的精液優(yōu)化處理技術(shù)或?qū)嶒?yàn)室檢測技術(shù)［16］，但結(jié)果均顯示，延長精液優(yōu)化處理后至IUI手術(shù)或體外授精間隔時(shí)間，會對精子質(zhì)量和臨床妊娠率產(chǎn)生負(fù)影響。

綜上所述，進(jìn)行IUI治療的精子獲能時(shí)間應(yīng)控制在40 min內(nèi)，能顯著改善患者的精子質(zhì)量，因此各生殖中心實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)不同病因患者選擇適當(dāng)?shù)木簝?yōu)化處理方法及精子體外獲能條件。精子體外獲能時(shí)間與ART臨床妊娠結(jié)局的關(guān)系仍需進(jìn)行更大樣本，更全面的前瞻性隨機(jī)對照研究進(jìn)一步驗(yàn)證，才能得出更準(zhǔn)確的結(jié)論。