鄭振坤，王彩蕓，劉 文

(青島科技大學 化工學院，山東 青島 266042)

芳香族氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的衍生物中，許多都是具有生物活性的天然產物。比如酪氨酸和苯丙氨酸可作為嗎啡、可待因等藥物的前體，又比如長春花堿、喜樹堿等化療藥物可以色氨酸為前體進行生產。

這些具有高價值的芳香族氨基酸衍生物可由生物自然產生，但其工業(yè)化生產卻不理想。因為天然生物提取法收率低，操作復雜；而且化合物復雜的結構造成其化學合成和商業(yè)化的困難[1]。合成生物學研究是在功能基因組學、計算生物學和系統(tǒng)生物學等基礎上，將工程化理念應用在生物學中，定向創(chuàng)造新型生物產品和生物過程整體優(yōu)化的新的研究方向[2]。在微生物中重建生物合成途徑，利用其代謝工程進行發(fā)酵生產高價值化合物的方法受到越來越多的關注。許多芳香族產品的生產仍處于初級階段，許多有價值的產品只重構了部分路徑。在這里，我們將討論一下這些重建產品的一些最新進展。

1 白藜蘆醇

白藜蘆醇是一種芪類化合物，廣泛存在于多種植物中。作為一種抗氧化劑，白藜蘆醇具有心臟保護、抗腫瘤和神經保護功能。此外，它還具有潛在的抗衰老功能。作為一種功能性營養(yǎng)品，白藜蘆醇具有非常廣闊的市場前景。

白藜蘆醇可以由酪氨酸或苯丙氨酸作為初始原料，在酵母中合成。孫萍等[3]利用降落-重疊延伸PCR法和一步等溫法，將擬南芥的4-香豆酰輔酶A連接酶基因(4cl)、巨峰葡萄的白藜蘆醇合酶基因(rs)以及粘紅酵母的酪氨酸解氨酶基因(tal)分別構建含有不同抗性篩選標記的附加型酵母表達載體，轉化釀酒酵母工業(yè)型菌株，最終發(fā)酵液中白藜蘆醇的產量為6.1979 mg/L。但是合成培養(yǎng)基中白藜蘆醇的濃度仍然相當?shù)?。另一項研究比較了使用富營養(yǎng)培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基對白藜蘆醇產量的影響，表明使用富營養(yǎng)培養(yǎng)基大大提高了白藜蘆醇的產量，用工業(yè)巴西甘蔗發(fā)酵，酵母生產的白藜蘆醇濃度高達391 mg/L[4]。

利用大腸桿菌表達生產白藜蘆醇也是可行的。朱屹東[5]以一株苯丙氨酸高產大腸桿菌菌株(酪氨酸缺陷型)為出發(fā)菌株，敲除了AroF基因和PheA基因，表達抗反饋抑制的tyrAfbr基因，同時將白藜蘆醇合成的必須基因TAL、4CL、STS整合至大腸桿菌基因組上，構建了一株強化了酪氨酸合成的白藜蘆醇生產菌株。在以葡萄糖為底物進行發(fā)酵培養(yǎng)后，檢測到白藜蘆醇產量達到了71.6 mg/L，相比全質粒體系的基因工程菌產量提高了20.3倍。林雅楠[6]使用攜帶大腸桿菌組成型強啟動子的質粒，無需加入誘導劑，保證了酶的表達和安全性，使白藜蘆醇的產量達到0.6g/L。

2 芐基異喹啉生物堿

芐基異喹啉類生物堿(BIAs)是一類具有重要研究及藥用價值的次生代謝產物，目前該類生物堿主要來源于植物，由酪氨酸衍生，包括嗎啡、可待因、非洲防己堿、小檗堿、血根堿等。異喹啉類生物堿的生物合成途徑開始于2種酪氨酸衍生物多巴胺和4-羥基苯乙醛的縮合，緊接著是一系列的反應形成反式牛心果堿，反式牛心果堿是大部分生物堿普遍的前體物質。

由于缺乏關鍵的生物合成步驟知識，只有部分途徑能夠重建，且要對中間體進行投料，導致許多BIAs的生產被限制。例如Mimami等[7]報道，使用共培養(yǎng)的大腸桿菌和酵母，重建部分途徑，生產阿樸菲生物堿木蘭堿 (7.2 mg/L)和原小檗堿生物堿斯氏紫堇堿(8.3 mg/L)。Hawkins 等[8]將(R,S)-全去甲勞丹堿轉換成 (R,S)-牛心果堿，產量為164.5 mg/L。最近，F(xiàn)ossati等[9]報道了用(R,S)-全去甲勞丹堿生產二氫血根堿的10個基因的途徑的重建，向包含所有酶的酵母菌株投料(R,S)-全去甲勞丹堿得到1.5%的二氫血根堿轉換率。

3 類黃酮

類黃酮是一類從高等植物中提取的多酚類次生代謝產物，在植物中廣泛存在，具有抗氧化和自由基清除活性，可以調節(jié)機體免疫力、抗病毒、抗癌、保護神經系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，是目前高端功能性營養(yǎng)化學品的代表。

柚皮素是許多黃酮類化合物的一種常見的前體，由苯丙氨酸或酪氨酸經數(shù)個生物合成步驟合成。吳俊俊[10]利用從頭設計原則異位重構了黃酮骨架物質生物合成途徑，結果大腸桿菌可以利用葡萄糖合成生松素和柚皮素的產量分別達到2.2 mg/L和4.5 mg/L。這類研究成為微生物生產類黃酮的一個重要的發(fā)展，可能為柚皮素的重要下游產品的生產鋪平道路。例如，最近有人成功將根皮素(一種矯味劑)在大腸桿菌中由柚皮素經查耳酮異構酶和烯酮還原酶表達合成[11]。

4 展望

我們討論了微生物代謝工程生產芳香族氨基酸衍生物領域的一些近展，然而其中還有許多未攻克的難點，主要障礙是許多有價值的化合物缺乏完整的生物合成途徑信息，所以重建整個生物合成途徑尚是一個挑戰(zhàn)。但我們相信，隨著合成生物學的發(fā)展，越來越多的工具和方法被應用，生物代謝途徑的研究也會更多元化，也將有更多的研究成果被應用于人類社會的生產和生活。

[1]De Luca V,Salim V，Atsumi S M，et al.Mining the biodiversity of plants：a revolution in the making[J].Science，2012，336：1658-1661.

[2]申曉林，袁其朋.生物合成芳香族氨基酸及其衍生物的研究進展[J].生物技術通報，2017，33(1)：24-34.

[3]孫 萍，郭麗瓊，黃佳俊，等.釀酒酵母工程菌生物合成白藜蘆醇[J].中國食品學報，2016，16(3)：68-74.

[4]Sydor T，Schaffer S，Boles E.Considerable increase in resveratrol production by recombinant industrial yeast strains with use of rich medium[J].Applied and Environmental Microbiology，2010，76：3361-3363.

[5]朱屹東.代謝工程改造大腸桿菌生產白藜蘆醇[D].無錫:江南大學，2016.

[6]林雅楠.重組大腸桿菌生物合成白藜蘆醇的條件研究[D].濟南:齊魯工業(yè)大學，2013.

[7]Minami H，Kim J S，Ikezawa N，et al.Microbial production of plant benzylisoquinoline alkaloids[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105：7393-7398.

[8]Hawkins K M，Smolke C D.Production of benzylisoquinoline alkaloids in Saccharomyces cerevisiae[J].Nat Chem Biol，2008，4：564-573.

[9]Fossati E，Ekins A，Narcross L，et al.Reconstitution of a 10-gene pathway for synthesis of the plant alkaloid dihydrosanguinarine in Saccharomyces cerevisiae[J].Nature Communications，2014，5：3283.

[10]吳俊俊.合成生物技術改造大腸桿菌生產黃酮骨架物質[D].無錫:江南大學，2015.

[11]Gall M，Thomsen M，Peters C，et al.Enzymatic conversion of flavonoids using bacterial chalcone isomerase and enoate reductase[J].Angewandte Chemie (International ed.in English)，2014，53：1439-1442.