于勝晨 郝小燕 武曉東 丁 娜 刁小高 項斌偉 張文佳 張建新*

(1. 山西農業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801；2. 山西省右玉縣畜牧局，右玉 037200)

山西省是胡麻的主要產區(qū)之一，總產量6.3萬t，胡麻餅(oil cake of flax seed，OCFS)是胡麻籽榨油的主要副產物，合理利用胡麻餅可以減少資源浪費。胡麻餅中含有豐富的多不飽和脂肪酸(PUFA)，如α-亞麻酸可以影響瘤胃微生物氫化途徑，調控瘤胃發(fā)酵模式，改變發(fā)酵終產物的形成[1-2]；此外，PUFA可以通過參與瘤胃內纖維消化和抑制產氫微生物的毒性作用來降低瘤胃甲烷生成[3-4]。武曉東等[5]研究表明，胡麻餅可以代替豆粕作為綿羊育肥期的蛋白質飼料來源，提高綿羊肉品質和機體抗氧化能力。胡麻餅中含有的亞麻籽膠是一種具有保健作用的膳食纖維[6]。除此之外，胡麻餅中礦物質、維生素和抗病氨基酸[7]等含量也較為豐富。

然而，胡麻餅也含有亞麻氰苷、抗維生素B6因子和植酸等抗營養(yǎng)因子。動物采食胡麻，其受損組織細胞中的β-葡萄糖苷酶和α-羥氰裂解酶接觸亞麻氰苷，使其降解并釋放有毒物質氰化氫(HCN)[8]，此物質對瘤胃的正常代謝和發(fā)育產生不利的影響。因此，研究胡麻餅對瘤胃代謝及發(fā)育的影響，對胡麻餅在反芻動物生產中的合理利用有重要意義。

本試驗以杜泊×小尾寒羊雜交F1代公羔為研究對象，通過測定瘤胃發(fā)酵、瘤胃液消化酶活性以及揮發(fā)性脂肪(VFA)吸收相關基因表達量，探討胡麻餅代替豆粕對綿羊瘤胃代謝的影響，并確定最適添加比例，為胡麻餅在反芻動物生產中的合理利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及設計

本試驗選取24只5月齡、體重為(26.0±1.0) kg、健康狀況良好的杜泊×小尾寒羊雜交F1代公羔為試驗動物，采用完全隨機分組試驗設計，將試驗羊隨機分為4組[對照(CK)、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組]，每組6只羊，分別飼喂胡麻餅代替豆粕的飼糧，胡麻餅添加比例分別為0、6%、12%和18%。

1.2 試驗飼糧

本試驗選用右玉某公司的胡麻餅，自然風干后貯存?zhèn)溆?，其營養(yǎng)成分見表1?；A飼糧參考NRC(2007)綿羊營養(yǎng)需要中體重25 kg、日增重300 g公羔的營養(yǎng)需要設計。試驗飼糧均為全混合日糧(TMR)顆粒，其組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 胡麻餅營養(yǎng)成分(干物質基礎)Table 1 Nutrient components of oil cake of flax seed (DM basis) %

表2 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

1)預混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of diets: Cu 15 mg, Fe 55 mg, Mn 40 mg, Se 0.3 mg, I 0.5 mg, Co 0.2 mg, VA 20 000 IU, VD 4 000 IU, VE 400 IU。
2)除消化能外，其他營養(yǎng)水平均為實測值。Beside DE, the other nutrient levels were measured values.

1.3 飼養(yǎng)管理

本試驗于2016年5月至2016年8月在山西省右玉縣宏宇種羊養(yǎng)殖基地進行。預試期10 d，正試期60 d。試驗羊分別于每天08：00和16：00進行2次飼喂。所有試驗羊單欄飼養(yǎng)，自由采食，自由飲水。

1.4 樣品的采集與測定

1.4.1 飼糧營養(yǎng)水平的測定

胡麻餅和試驗飼糧的干物質(DM)、粗灰分(Ash)、粗脂肪(EE)和粗蛋白質(CP)含量參考張麗英[9]方法測定；酸性洗滌纖維(ADF)和中性洗滌纖維(NDF)含量參考Van Soest等[10]方法并結合ANKOM濾袋技術利用ANKOM A200i型半自動分析儀測定；鈣(Ca)含量采用原子吸收分光光度計(EWAI，AA-7020)測定[11]，磷(P)含量采用紫外分光光度計(Mapada, UV-1800PC)測定[12]。消化能(DE)為計算值，計算公式為：

DE=19.509-0.170×NDF-0.006×(DM-Ash)-0.097×CP (R2=0.973，P<0.001)[13]。

1.4.2 生長性能的測定

平均日采食量(ADFI)：在整個試驗期每天準確稱量記錄每只試驗羊的喂料量和剩料量，計算ADFI(非干物質條件下)。平均日增重(ADG)：所有試驗羊在正試期第1天進行空腹稱重，每隔30 d空腹稱重1次，計算ADG。根據(jù)ADG和ADFI計算料重比(F/G)：

F/G=ADFI/ADG。

1.4.3 樣品的采集

試驗期結束的當天20：00時對所有試驗羊進行禁食禁水12 h，次日08：00空腹屠宰。屠宰后，取出瘤胃，用剪刀沿瘤胃冠狀溝將其剝開，迅速用無菌燒杯從瘤胃不同部位采集瘤胃液，用4層無菌紗布過濾，利用PHS-3G型pH計實時測定pH。同時取10 mL瘤胃液于15 mL離心管內，液氮速凍，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｇ蹇樟鑫竷热菸锊⒂蒙睇}水將瘤胃壁沖洗干凈，采集1塊1 cm2左右的瘤胃左側背囊，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 瘤胃發(fā)酵指標的測定

準確稱量25 g偏磷酸和0.646 4 g巴豆酸定容于100 mL容量瓶中配制成去蛋白質溶液。取1.5 mL瘤胃液，10 621×g離心10 min，然后取1 mL上清液加入0.2 mL的去蛋白質溶液，混合均勻，30 min冰水浴后15 294×g離心5 min，利用氣相色譜儀(Thermo Fisher，Trace GC)測定VFA濃度[14]。參照亞硝基鐵氰化鈉-次氯酸鈉比色法并利用紫外分光光度計測定氨態(tài)氮(NH3-N)濃度[15]。利用乳酸檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定乳酸濃度。取1 mL瘤胃液，430×g離心5 min，去除原蟲和飼糧顆粒后，參照Makkar等[16]的比色法測定瘤胃微生物蛋白(MCP)濃度。

瘤胃液消化酶活性測定：按照Agarwal等[17]的方法測定瘤胃液羥甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和果膠酶的活性。α-淀粉酶和蛋白酶活性分別采用α-淀粉酶檢測試劑盒和胃蛋白酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定。

1.4.5 瘤胃背囊組織VFA吸收相關基因mRNA相對表達量的測定

將采集的瘤胃背囊組織在液氮環(huán)境下利用直徑為8 cm的陶瓷研缽迅速磨成粉末狀，取35～70 mg置于裝有750 μL Trizol的1.5 mL的EP管中，用勻漿儀(Polytron，PT 1200E)勻漿處理，提取總RNA[18]。提取的總RNA利用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉錄合成cDNA，并檢測cDNA濃度。在NCBI上查找目的基因單羧酸轉運蛋白1(mono-carboxylate transporters 1，MCT1)、單羧酸轉運蛋白4(mono-carboxylate transporters 4，MCT4)、陰離子交換蛋白2(anion exchanger 2，AE2)、腺瘤下調蛋白(down regulated in adenoma，DRA)、Na+/H+交換蛋白(Na+/H+exchange，NHR3)以及內參基因核糖體大亞基蛋白L13(ribosomal protein L13，RpL13)的序列[15]，利用Primer3在線設計引物(表3)，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。采用熒光定量PCR儀，以合成的cDNA為模板進行定量分析，結果根據(jù)2-△△CT法計算。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

本試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010進行初步整理，采用SPSS 22.0進行單因素方差分析，并用Duncan氏法進行多重比較，結果表示為平均值±標準差。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 飼糧中胡麻餅代替豆粕對綿羊生長性能的影響

由表4可見，與CK組相比，Ⅰ和Ⅱ組的ADG和ADFI無顯著差異(P>0.05)，但Ⅲ組ADFI顯著降低(P<0.05)。Ⅱ組的料重比顯著低于CK組(P<0.05)，Ⅰ和Ⅲ組與CK組無顯著差異(P>0.05)。

表3 基因引物序列Table 3 Primer sequences of genes

表4 飼糧中胡麻餅代替豆粕對綿羊生長性能的影響Table 4 Effects of replacement of soybean meal by oil cake of flax seed in diets on growth performance of sheep

同行數(shù)據(jù)肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。
In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 飼糧中胡麻餅代替豆粕對綿羊瘤胃液中消化酶活性的影響

由表5可見，胡麻餅代替豆粕對綿羊瘤胃液α-淀粉酶活性無顯著影響(P>0.05)。Ⅱ和Ⅲ組的瘤胃液羥甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和蛋白酶活性顯著高于CK組(P<0.05)。Ⅲ組的瘤胃液木聚糖酶活性顯著高于CK和Ⅰ組(P<0.05)。Ⅲ組的瘤胃液果膠酶活性顯著高于其他組(P<0.05)，且其他組之間無顯著差異(P>0.05)。

表5 飼糧中胡麻餅代替豆粕對綿羊瘤胃液中消化酶活性的影響Table 5 Effects of replacement of soybean meal by oil cake of flax seed in diets on rumen digestion enzyme activity of sheep U/mL

2.3 飼糧中胡麻餅代替豆粕對綿羊瘤胃發(fā)酵的影響

由表6可見，胡麻餅代替豆粕對綿羊瘤胃液pH無顯著影響(P>0.05)。Ⅱ組的瘤胃液乙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度顯著高于CK、Ⅰ和Ⅲ組(P<0.05)，且這3組之間無顯著差異(P>0.05)；不同胡麻餅添加比例對瘤胃液丙酸濃度和乙丙比均無顯著影響(P>0.05)。與CK組相比，3個胡麻餅添加組的瘤胃液NH3-N濃度顯著降低(P<0.05)，MCP濃度顯著升高(P<0.05)，且這3組之間無顯著差異(P>0.05)；不同胡麻餅添加比例對瘤胃液乳酸濃度無顯著影響(P>0.05)。

表6 飼糧中胡麻餅代替豆粕對綿羊瘤胃發(fā)酵的影響Table 6 Effects of replacement of soybean meal by oil cake of flax seed in diets on rumen fermentation of sheep

2.4 飼糧中胡麻餅代替豆粕對綿羊瘤胃上皮組織VFA吸收相關基因表達的影響

由圖1-A和圖1-B所示，Ⅱ組的MCT1和MCT4的mRNA相對表達量顯著高于CK和Ⅲ組(P<0.05)，但與Ⅰ組無顯著差異(P>0.05)。胡麻餅代替豆粕對AE2的mRNA相對表達量無顯著影響(P>0.05)(圖1-C)。CK和Ⅰ組的DRA的mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)，但Ⅱ和Ⅲ組顯著低于CK組(P<0.05)(圖1-D)。Ⅲ組NHE3的mRNA相對表達量顯著高于CK組(P<0.05)，CK、Ⅰ和Ⅱ組之間無顯著差異(P>0.05)(圖1-E)。

3 討 論

3.1 飼糧中胡麻餅代替豆粕對綿羊瘤胃液中消化酶活性的影響

飼糧在瘤胃內的消化需要多種消化酶協(xié)同完成，羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶及果膠酶活性能夠反映瘤胃對飼糧中纖維的降解能力；淀粉酶和蛋白酶活性能夠顯示瘤胃對飼糧中淀粉和蛋白質的降解能力。大部分的消化酶是由瘤胃微生物分泌的胞內酶和胞外酶[15]，本試驗所研究的是胞外酶活性。胡麻餅中植酸磷含量在0.02%～0.24%，而豆粕中植酸磷含量高達0.43%，植酸磷可以同淀粉酶和胃蛋白酶相結合，從而影響瘤胃液消化酶活性[19]。本試驗研究顯示，隨著胡麻餅代替豆粕比例的增加，瘤胃液羥甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶酶、木聚糖酶、果膠酶和蛋白酶活性顯著升高，這與王蕾等[20]研究一致。一方面，胡麻餅中含有豐富的α-亞麻酸，其可以作為前體物質影響瘤胃微生物的屬性[1]，而且胡麻餅含有豐富的B族維生素，兩者都有利于瘤胃微生物的生長，從而提高消化酶的產量；同時B族維生素還可作為輔酶或是輔酶的主要成分，起到催化作用。另一方面，亞麻籽膠可以提高瘤胃微生物黏附飼糧的能力[21]，亞麻籽膠吸水膨脹，有利于微生物在飼糧表面附著，促進瘤胃微生物的生長，增加消化酶的分泌。

3.2 飼糧中胡麻餅代替豆粕對綿羊瘤胃發(fā)酵的影響

瘤胃液pH是反映瘤胃發(fā)酵水平和瘤胃內環(huán)境狀況的一項綜合性指標[22]，受食入飼糧在瘤胃內的發(fā)酵產物VFA和乳酸等指標影響[23]。本研究中各組瘤胃液pH無顯著差異，且均在正常范圍(5.5～7.5)之內[24]，這與Benchaar等[25]研究一致。

數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05).
圖1飼糧中胡麻餅代替豆粕對綿羊瘤胃上皮組織中VFA吸收相關基因表達mRNA相對表達量的影響
Fig.1 Effects of replacement of soybean meal by oil cake of flax seed in diets on mRNA relative expression level of genes related to VFA absorption in rumen epithelial tissue of sheep

飼糧中的碳水化合物通過瘤胃微生物發(fā)酵產生的VFA，其不僅是瘤胃利用飼糧碳水化合物的終產物，而且是反芻動物能量利用的主要形式[26]，瘤胃VFA的產量和組成比例是評述瘤胃發(fā)酵方式和能量轉化的直接指標。本試驗中，添加12%胡麻餅顯著提高了瘤胃液乙酸、丁酸和TVFA濃度，這主要是因為適量胡麻餅增加了纖維消化酶的分泌，提高纖維消化酶活性，從促進瘤胃液中的乙酸和丁酸的生成。但胡麻餅18%添加組的瘤胃液乙酸、丁酸和TVFA濃度卻顯著低于12%添加組，可能是因為隨著胡麻餅添加比例增加，PUFA堆積程度超過了部分瘤胃微生物對PUFA的氫化能力，從而影響瘤胃發(fā)酵[27]。胡麻餅的添加并沒有對乙丙比產生顯著的影響，即沒有改變瘤胃內的發(fā)酵類型，這與Martin等[2]研究的亞麻籽可以改變瘤胃發(fā)酵類型并不矛盾：一方面，在本試驗條件下，隨著胡麻餅的添加，CP含量逐漸降低，卻能為發(fā)酵碳水化合物的瘤胃微生物提供充足的氮源，是因為胡麻餅蛋白質具有更好的持水性和乳化性[21]；同時胡麻餅提供的CP幾乎不含動物無法利用的醇溶蛋白，而其富含的清蛋白、谷蛋白和球蛋白都能夠很好地被瘤胃微生物消化利用[28]；胡麻餅的添加同樣能為瘤胃發(fā)酵提供配合平衡的瘤胃降解蛋白(RDP)和瘤胃非降解蛋白(RUP)[29]；而大豆中含有的植酸磷、胰蛋白酶抑制劑和大豆凝血素等抗營養(yǎng)因子降低了大豆蛋白的利用率[30]。另一方面，胡麻餅相對于亞麻籽，脂肪的含量和種類發(fā)生一定的變化，而飼糧中添加植物油對瘤胃VFA的影響與脂肪添加量和種類等有關[31]。

瘤胃液中NH3-N濃度是反映瘤胃氮代謝的重要指標，主要受瘤胃壁的吸收、食糜的排空速度及MCP合成效率等綜合影響[32]。Murphy等[33]指出，瘤胃微生物生長的適宜NH3-N濃度為6.3～27.5 mg/dL。本試驗中胡麻餅代替豆粕顯著降低了NH3-N在瘤胃液中的濃度，這與Jalc等[34]研究一致。一方面胡麻餅中的亞麻籽膠可以有效地促進瘤胃壁的吸收和食糜的排空速度[35]，另一方面可能是胡麻餅促進了瘤胃液中NH3-N合成MCP。瘤胃能氮同步釋放的理論基礎是瘤胃內微生物對食入飼糧中氮和能量的選擇性、依賴性和時效性，而MCP濃度是能氮同步性最直接的表現(xiàn)結果[36]。MCP能氮同步說明飼糧底物在瘤胃內的可發(fā)酵有機物(FOM)被發(fā)酵的速度和可降解氮(RDN)被降解的速度相互同步。本研究顯示，飼糧中胡麻餅代替豆粕顯著提高了瘤胃液MCP濃度，可能是因為胡麻餅能夠代替豆粕為瘤胃液提供更為合適的FOM/RDN比例，同時也與胡麻餅促進NH3-N合成MCP的結果相符。NH3-N濃度的降低和MCP濃度的升高，是否能說明胡麻餅代替豆粕促進了NH3-N向MCP的轉化，還需要進一步的研究。

3.3 飼糧中胡麻餅代替豆粕對綿羊瘤胃上皮組織VFA吸收相關基因表達的影響

4 結 論

飼喂胡麻餅添加比例為12%的飼糧降低了綿羊的料重比，提高了瘤胃乙酸、丁酸和TVFA的濃度，降低NH3-N的濃度，同時提高MCP濃度；增強了羥甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和蛋白酶的活性；同時也提高了VFA吸收相關基因(MCT1、MCT4和NHE3)的相對表達量，降低DRA的mRNA相對表達量。綜上，在本研究條件下，綿羊飼糧中胡麻餅代替一定比例的豆粕能夠改善瘤胃的代謝，且飼糧中胡麻餅適宜添加比例為12%。