張樹敏 廖秀冬 呂 林 張麗陽 羅緒剛

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，礦物元素營養(yǎng)研究室，北京 100193)

小腸是動物重要的消化器官，是營養(yǎng)物質(zhì)主要的消化與吸收的場所。而小腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells，IEC)作為體內(nèi)更新最快的一類細(xì)胞，是腸道內(nèi)外環(huán)境的媒介，又是機(jī)體免疫屏障的重要組成部分，具有消化、吸收、分泌、免疫等重要的生理功能[1]。小腸上皮細(xì)胞在一定條件下可進(jìn)行體外分離和培養(yǎng)。體外分離培養(yǎng)小腸上皮細(xì)胞對于研究腸道生物學(xué)功能、營養(yǎng)物質(zhì)吸收機(jī)制及其調(diào)控以及小腸上皮細(xì)胞增殖和分化提供了簡單、快速的手段，并為研究營養(yǎng)素及其他外界因素對腸上皮的作用提供了理想的體外模型[2]。一般而言，體外培養(yǎng)胚胎組織比成體組織更易生存和生長，因而其細(xì)胞分離后容易培養(yǎng)成功。而成體組織中大部分是非繁殖的分化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞分化時生長受到嚴(yán)重抑制或完全停止，并且成體組織的年齡越大，體外培養(yǎng)的成功率越低，這可能與胚胎干細(xì)胞的分化水平有關(guān)，故成體來源組織培養(yǎng)細(xì)胞增殖極為困難，且培養(yǎng)周期縮短[3]。李艷等[4]選取9胚齡雞胚，Guo等[5]選取17胚齡雞胚，馬玉龍等[6]和古少鵬等[7]選取18胚齡雞胚，Derache等[8]選用大于18胚齡的將出殼雞胚，賈國東等[9]選取20胚齡雞胚進(jìn)行小腸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，均已成功構(gòu)建小腸上皮細(xì)胞體外原代培養(yǎng)模型。以上文獻(xiàn)中選取的雞胚多集中在18胚齡左右，故本試驗(yàn)選用18胚齡雞胚十二指腸上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。但是關(guān)于原代培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞用于物質(zhì)吸收試驗(yàn)未見報(bào)道，有諸多研究用Caco-2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)作為物質(zhì)吸收模型[10-13]，并進(jìn)行其單層模型細(xì)胞緊密連接性的評估[14-15]。本實(shí)驗(yàn)室前期Liu等[16]用半體內(nèi)半體外的原位結(jié)扎灌注腸段法研究發(fā)現(xiàn)，磷在肉雞原位結(jié)扎灌注腸段中的主要吸收腸段是十二指腸，胡義信[17]用自然飼喂法進(jìn)一步深入研究證實(shí)磷在肉雞自然飼喂過程中的主要吸收腸段是十二指腸，與Liu等[16]研究結(jié)果一致。在以上2個試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用體外原代培養(yǎng)十二指腸上皮細(xì)胞的方法，可進(jìn)一步證實(shí)磷在肉雞雞胚原代培養(yǎng)十二指腸上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收規(guī)律及其分子機(jī)制。因此，本研究采用Caco-2細(xì)胞評估其單層模型細(xì)胞連接緊密性的方法，來評估十二指腸上皮細(xì)胞不同接種密度在不同培養(yǎng)時間下對細(xì)胞連接緊密性及細(xì)胞活力的影響，為建立肉雞雞胚體外原代培養(yǎng)十二指腸上皮細(xì)胞吸收模型選擇最佳的細(xì)胞接種密度，并最終構(gòu)建十二指腸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的物質(zhì)吸收模型。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)3個組，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組十二指腸上皮細(xì)胞接種密度分別為2.90×106、6.25×106、8.75×106個/mL，每個組6個重復(fù)，每個重復(fù)包含2個培養(yǎng)孔。

1.2 試驗(yàn)動物

18胚齡的愛拔益加(AA)肉雞雞胚，由河北灤平華都肉雞公司提供。

1.3 主要試劑和儀器

主要試劑：杜氏磷酸鹽緩沖液(D-PBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、臺盼藍(lán)、膠原酶Ⅰ，購于Gibco公司；青-鏈霉素、肝素鈉，購于Sigma公司；表皮細(xì)胞生長因子、噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒，購于上海凡歌生物化工公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)(BCIP/NBT)堿性磷酸酯酶顯色試劑盒，購于碧云天生物技術(shù)研究所；鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、4%多聚甲醛，購于武漢博士德生物工程有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；細(xì)胞角蛋白18抗體，購于博奧森公司；胰島素，購于邁晨科技(北京)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：150、500目細(xì)胞過濾篩(北京索萊寶科技有限公司)，超純水凈化裝置(Milli-Q，美國Biocell公司)，自動滅菌鍋(TOMY SS-325)，臺式離心機(jī)(Eppendorf)，0.22 μm濾器(美國Millipore公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，相差倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，超凈工作臺(YJ-1450型醫(yī)用凈化工作臺，蘇州長橋凈化設(shè)備廠)，Millicell-ERS電阻儀(美國Millipore公司)，50 mL離心管、60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)，全波長酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)。

1.4 AA肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞的消化、分離

參考Guo等[5]和Qin等[18]的消化分離細(xì)胞的方法，取18胚齡AA肉雞雞胚，用75%酒精擦其外殼，晾干后在無菌條件下取出十二指腸，用解剖器械取出腸組織，置于盛有預(yù)冷的含2%青-鏈霉素的D-PBS中，用鑷子剔除十二指腸中夾帶的胰臟及其筋膜，用含2%青-鏈霉素的D-PBS反復(fù)清洗2～3次。用剪刀將十二指腸組織剪成0.5 cm長的小段，轉(zhuǎn)移至盛有30 mL DMEM/F12培養(yǎng)基的50 mL離心管中，劇烈振蕩數(shù)次，將清洗液吸出，重復(fù)2～3次。然后將腸段剪成小于1 mm3的組織塊碎片，靜置數(shù)分鐘自行沉淀，用DMEM/F12腸段清洗液沖洗3～4次至上清液澄清，吸棄洗液。

向沉淀中加入10倍體積的1 mg/mL膠原酶Ⅰ消化液消化，在37 ℃水浴箱中慢速(80循環(huán)/min)振蕩消化50 min，消化完畢后，于1 000×g離心8 min，棄上清去除酶消化液。繼續(xù)向沉淀中加入10 mL DMEM/F12腸段清洗液懸浮沉淀，輕輕吹打混勻，于1 000×g離心8 min，棄上清，重復(fù)該洗滌操作1～2次。加入10 mL DMEM/F12貼壁培養(yǎng)液懸浮沉淀，反復(fù)輕柔吹打5～10次，用150和500目的細(xì)胞篩連續(xù)過濾懸液以去除組織塊和成纖維細(xì)胞，留在500目篩上的細(xì)胞團(tuán)用DMEM/F12貼壁培養(yǎng)液沖洗下來，制成細(xì)胞懸液，用臺盼藍(lán)染色法進(jìn)行十二指腸上皮細(xì)胞活細(xì)胞率的檢測。

1.5 AA肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞活細(xì)胞率的檢測

用彭彬等[19]使用的臺盼藍(lán)染色法進(jìn)行十二指腸上皮細(xì)胞活細(xì)胞率檢測。主要步驟為：取200 μL細(xì)胞懸液，加入等量0.4%的臺盼藍(lán)溶液，混勻后取1滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，輕輕蓋上蓋玻片，于相差倒置顯微鏡下觀察。分別計(jì)數(shù)未染色的細(xì)胞數(shù)(活細(xì)胞)和染色的細(xì)胞數(shù)(死細(xì)胞)?；罴?xì)胞率計(jì)算：

活細(xì)胞率(%)=100×活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))。

當(dāng)活細(xì)胞率達(dá)到95%以上時，可用于以下的十二指腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)。

1.6 AA肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

采用DMEM/F12培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，另外添加胎牛血清濃度為3%，用制成的DMEM/F12貼壁培養(yǎng)液將獲得的十二指腸上皮細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行懸浮，制成細(xì)胞懸液，當(dāng)活細(xì)胞率達(dá)到95%以上且按照以上試驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)整細(xì)胞密度，隨即取1.5 mL細(xì)胞懸液接種于Transwell 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的上槽中，另取沒有細(xì)胞的DMEM/F12培養(yǎng)基2.6 mL于Transwell 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的下槽中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，共培養(yǎng)4 d。

1.7 AA肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞堿性磷酸酶染色鑒定

采用洪智敏等[2]的方法進(jìn)行雞胚十二指腸上皮細(xì)胞堿性磷酸酶染色鑒定。原代培養(yǎng)的十二指腸上皮細(xì)胞貼壁生長48 h后，選取已接種培養(yǎng)細(xì)胞的1塊6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，吸出6個培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液并以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，洗去未貼壁細(xì)胞及碎片雜質(zhì)，并加入4%多聚甲醛固定液固定30 min。隨后以PBS洗滌2次去除固定液，即可用于鑒定。其中3個培養(yǎng)孔作為陽性試驗(yàn)組，3個培養(yǎng)孔作為陰性對照組。具體操作步驟按照BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒說明進(jìn)行。

1.8 樣品采集與制備

在細(xì)胞培養(yǎng)的第24、48、72、96 h，立即收集培養(yǎng)孔上槽中細(xì)胞培養(yǎng)液0.5 mL于滅菌的1.5 mL離心管中，將2個培養(yǎng)孔的細(xì)胞培養(yǎng)液收集合為1個重復(fù)，共收集6個重復(fù)，于3 500 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清置于-20 ℃冰箱中保存，以備測定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力；隨即棄去Transwell 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上、下槽中剩余細(xì)胞培養(yǎng)液，用含酚紅培養(yǎng)基和無酚紅培養(yǎng)基測定細(xì)胞酚紅透過率，細(xì)胞樣品收集于滅菌的1.5 mL離心管中，置于-20 ℃冰箱中保存以備測定其酚紅透過率；用Millcell-ERS電阻儀測量每個培養(yǎng)孔的跨膜電阻(transepithelial electrical resistance,TEER)值。連續(xù)測定收集4 d。

1.9 樣品分析

分別于細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后，取上、下槽培養(yǎng)液0.5 mL于具塞試管中，分別加入1 mol/L NaOH溶液5 mL顯色，搖勻后以1 mol/L NaOH溶液為空白，在560 nm下測定吸光度(OD)。按以下公式計(jì)算細(xì)胞酚紅透過率：

酚紅透過率(%)=100×OD下層/(OD上層+OD下層)。

細(xì)胞生長孔TEER值計(jì)算：

TEER值(Ω·cm2)=(細(xì)胞生長孔值-空白孔值)×微孔面積。

式中：微孔面積為Transwell 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板插入槽的面積，為4.67 cm2。

將每天收集的6個重復(fù)的細(xì)胞培養(yǎng)液解凍，參照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書步驟進(jìn)行LDH活力測定。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SAS 9.0[20]軟件中一般線性模型(general linear model,GLM)程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以每個重復(fù)分析樣本作為1個試驗(yàn)單元。方差分析差異顯著者，以最小顯著差數(shù)法(least significant difference,LSD)比較平均值間的差異顯著性。以P<0.05作為數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 體外原代培養(yǎng)AA肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞分離觀察結(jié)果

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，可獲得大量的十二指腸上皮細(xì)胞團(tuán)和極少量的單個腸上皮細(xì)胞，剛分離的十二指腸上皮細(xì)胞團(tuán)呈球形，且細(xì)胞團(tuán)的大小均一，懸浮于培養(yǎng)液中(圖1-A)。Ⅰ組細(xì)胞團(tuán)之間空隙較大，Ⅱ組細(xì)胞團(tuán)之間仍有較多空隙，Ⅲ組細(xì)胞團(tuán)之間的空隙明顯變小，經(jīng)臺盼藍(lán)染色鑒定，3個組細(xì)胞活率均在95%以上，以上結(jié)果表明，此次分離獲得的十二指腸上皮細(xì)胞適用于原代細(xì)胞培養(yǎng)模型的構(gòu)建。

2.2 體外原代培養(yǎng)AA肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

在倒置生物顯微鏡下每隔24 h觀察各處理細(xì)胞生長狀態(tài)、形態(tài)特征。在細(xì)胞培養(yǎng)的24 h，十二指腸上皮細(xì)胞團(tuán)沉于培養(yǎng)板底部，已經(jīng)開始貼壁，貼壁的細(xì)胞團(tuán)開始向外伸展，逐漸鋪成片；Ⅰ組的細(xì)胞團(tuán)貼壁伸展較好，貼壁后的細(xì)胞表面較為平整；Ⅱ組仍可見部分未完全伸展開的細(xì)胞團(tuán)；Ⅲ組可見大量未伸展開的細(xì)胞團(tuán)(圖1-B)。在細(xì)胞培養(yǎng)的48 h，Ⅰ組和Ⅱ組的已貼壁細(xì)胞之間界限清晰，排列緊密，細(xì)胞呈單層分布，多呈卵石狀、橢圓狀，排列緊密，細(xì)胞呈“鋪路石樣”生長；Ⅲ組細(xì)胞間界限模糊，有較多未貼壁的死亡細(xì)胞團(tuán)依附在上面(圖1-C)。在細(xì)胞培養(yǎng)的72 h，Ⅰ組和Ⅱ組的細(xì)胞界限依然較為清晰，排列緊密，細(xì)胞呈單層分布，依然可見“鋪路石樣”生長的細(xì)胞；Ⅲ組細(xì)胞模糊不清，細(xì)胞脫落明顯(圖1-D)。在細(xì)胞培養(yǎng)的96 h，3個組的細(xì)胞都開始有部分脫落，細(xì)胞形狀開始變得模糊不清，此時細(xì)胞基本上不再增殖；Ⅰ組和Ⅱ組已貼壁的十二指腸上皮細(xì)胞之間界限變得模糊不清，開始有部分脫落；Ⅲ組細(xì)胞脫落后留下許多空泡，細(xì)胞脫落明顯(圖1-E)。以上結(jié)果表明，Ⅰ組和Ⅱ組細(xì)胞在培養(yǎng)的48和72 h，細(xì)胞之間界限清晰、生長狀態(tài)良好、貼壁均勻，具備了做試驗(yàn)處理的條件。

圖1 原代培養(yǎng)不同時間肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞形態(tài)變化Fig.1 Morphological change of primary cultured duodenal epithelial cells of broiler embryos under different cultivated time

2.3 AA肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞堿性磷酸酶染色鑒定結(jié)果

在原代培養(yǎng)的十二指腸上皮細(xì)胞貼壁生長48 h后，以Ⅰ組的細(xì)胞為例，采用洪智敏等[2]的方法進(jìn)行十二指腸上皮細(xì)胞堿性磷酸酶染色鑒定，結(jié)果見圖2。陽性試驗(yàn)組的十二指腸上皮細(xì)胞胞漿被染成了藍(lán)黑色(染色率在95%以上)，成纖維細(xì)胞或血細(xì)胞等雜細(xì)胞不著色，另外，陰性對照組的十二指腸上皮細(xì)胞未被染色。以上結(jié)果表明，本試驗(yàn)所獲得的細(xì)胞是分化完全、功能健全的十二指腸上皮細(xì)胞。

圖2 原代培養(yǎng)48 h肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞堿性磷酸酶染色情況Fig.2 Alkaline phosphatase staining of primary cultured duodenal epithelial cells of broiler embryos after 48 h cultivations

2.4 十二指腸上皮細(xì)胞TEER值測定結(jié)果

在細(xì)胞培養(yǎng)的24、48、72、96 h，對已貼壁的十二指腸上皮細(xì)胞測定其TEER值，見圖3。從相同細(xì)胞密度不同培養(yǎng)時間角度看，3個組細(xì)胞的TEER值均隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間的變化有顯著差異(P<0.05)，Ⅰ組和Ⅱ組細(xì)胞的TEER值的變化趨勢相似，Ⅰ組細(xì)胞的TEER值在細(xì)胞培養(yǎng)的48和72 h均顯著高于24和96 h(P<0.05)，并且在48和72 h，細(xì)胞的TEER值維持恒定不變(P>0.05)；Ⅱ組細(xì)胞的TEER值在細(xì)胞培養(yǎng)的48 h顯著高于24和96 h(P<0.05)；Ⅲ組細(xì)胞的TEER值在細(xì)胞培養(yǎng)的24 h時最高，在48、72和96 h均顯著降低(P<0.05)。

從相同培養(yǎng)時間不同細(xì)胞密度角度看，在細(xì)胞培養(yǎng)的24 h，Ⅰ組細(xì)胞的TEER值顯著低于Ⅱ組和Ⅲ組(P<0.05)；在細(xì)胞培養(yǎng)的48、72和96 h，Ⅰ組細(xì)胞的TEER值顯著高于Ⅱ組(P<0.05)，Ⅱ組細(xì)胞的TEER值顯著高于Ⅲ組(P<0.005)。從數(shù)值上看，Ⅰ組和Ⅱ組細(xì)胞的TEER值在48 h均達(dá)到最高狀態(tài)并持續(xù)到72 h，且Ⅰ組細(xì)胞的TEER值均大于Ⅱ組。

2.5 十二指腸上皮細(xì)胞酚紅透過率測定結(jié)果

在細(xì)胞培養(yǎng)的24、48、72、96 h，對已貼壁的十二指腸上皮細(xì)胞測定其酚紅透過率，見圖4。從相同細(xì)胞密度不同培養(yǎng)時間角度看，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組細(xì)胞的酚紅透過率均隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間的變化有顯著差異(P<0.05)，Ⅰ組和Ⅱ組細(xì)胞的酚紅透過率的變化趨勢相似，在細(xì)胞培養(yǎng)的24、48和72 h，細(xì)胞的酚紅透過率隨細(xì)胞培養(yǎng)時間的推移而顯著降低(P<0.05)，在細(xì)胞培養(yǎng)的96 h，細(xì)胞的酚紅透過率顯著增加(P<0.05)；Ⅲ組細(xì)胞的酚紅透過率在細(xì)胞培養(yǎng)的24和48 h時均較低，在細(xì)胞培養(yǎng)的72和96 h均顯著增高(P<0.05)。

數(shù)據(jù)點(diǎn)不同小寫字母表示相同細(xì)胞密度不同培養(yǎng)時間之間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示相同培養(yǎng)時間不同細(xì)胞密度之間差異顯著(P<0.05)。下圖同。
Value datapoints with different small letters mean significant difference in the same cell density at different culture time (P<0.05), and with different capital letters mean significant difference at the same culture time in different cell density (P<0.05). The same as below.
圖3原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞的TEER值
Fig.3 TEER values of primary cultured duodenal epithelial cells of broiler embryos (n=6)

從相同培養(yǎng)時間不同細(xì)胞密度角度看，在細(xì)胞培養(yǎng)的48、72和96 h，Ⅰ組和Ⅱ組的細(xì)胞酚紅透過率均顯著低于Ⅲ組(P<0.05)。

圖4 原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞的酚紅透過率Fig.4 Phenol red transmittance rate of primary cultured duodenal epithelial cells of broiler embryos (n=6)

2.6 十二指腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力測定結(jié)果

在細(xì)胞培養(yǎng)的24、48、72、96 h，測定細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力，見圖5。從相同細(xì)胞密度不同培養(yǎng)時間角度看，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力均隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間的變化有顯著差異(P<0.05)，Ⅰ組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力在細(xì)胞培養(yǎng)的24、48和72 h沒有顯著變化(P>0.05)，在細(xì)胞培養(yǎng)的96 h顯著增加(P<0.05)；Ⅱ組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力在細(xì)胞培養(yǎng)的24、48 h均在較低水平，在細(xì)胞培養(yǎng)的72、96 h顯著增高(P<0.05)；Ⅲ組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力在細(xì)胞培養(yǎng)的24、48和72 h隨細(xì)胞培養(yǎng)時間的推移而顯著增高(P<0.05)，在細(xì)胞培養(yǎng)的96 h顯著降低(P<0.05)。

從相同培養(yǎng)時間不同細(xì)胞密度角度看，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力在24、48、72 h均有顯著差異(P<0.05)，在細(xì)胞培養(yǎng)的24和48 h，Ⅰ組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力顯著低于Ⅱ組(P<0.05)，Ⅱ組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力顯著低于Ⅲ組(P<0.05)；在細(xì)胞培養(yǎng)的72 h，Ⅰ組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力顯著低于Ⅲ組(P<0.05)，Ⅲ組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力顯著低于Ⅱ組(P<0.05)；在細(xì)胞培養(yǎng)的96 h，Ⅰ組和Ⅱ組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力均顯著高于Ⅲ組(P<0.05)。從數(shù)值上看，Ⅰ組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力在細(xì)胞培養(yǎng)的24、48、72 h均維持在較低的水平，在細(xì)胞培養(yǎng)的96 h開始明顯升高。

圖5 原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力Fig.5 LDH activity of primary cultured duodenal epithelial cells medium of broiler embryos (n=6)

3 討 論

常用的細(xì)胞純化的方法主要有差速貼壁法、機(jī)械刮除法和用細(xì)胞篩篩選等方法。差速貼壁法主要利用成纖維細(xì)胞比腸道上皮細(xì)胞貼壁速度快的特點(diǎn)，大部分成纖維細(xì)胞能在短時間內(nèi)(1～2 h)完成附著過程，而大部分腸上皮細(xì)胞在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，此時收集未貼壁的含大量腸上皮細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞懸液，重新接種于新的培養(yǎng)板中，利用此差別可以純化細(xì)胞，從而獲得較多的腸上皮細(xì)胞團(tuán)。許多研究利用差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞，從而獲得腸上皮細(xì)胞團(tuán)[4-5,9]。但用這種方法進(jìn)行操作，會損失掉一部分已貼壁的腸上皮細(xì)胞團(tuán)，使細(xì)胞懸液中腸上皮細(xì)胞團(tuán)的密度降低，且成纖維細(xì)胞無法去除干凈。在原代培養(yǎng)時，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞往往會分區(qū)成片混雜生長，每種細(xì)胞都以小片或成區(qū)域的分布方式生長在瓶壁上，采用機(jī)械刮除的方法去除不需要的成纖維細(xì)胞區(qū)域而保留需要的上皮細(xì)胞區(qū)域，用這種方法往往容易造成污染、細(xì)胞在培養(yǎng)孔孔底分布不均勻等情況。用150～500目的細(xì)胞篩連續(xù)過濾細(xì)胞懸液，先用150目細(xì)胞篩來篩除未被消化的較大組織塊，然后用500目篩篩除直徑較小的血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和單個腸上皮細(xì)胞，而直徑相對較大的腸上皮細(xì)胞團(tuán)無法經(jīng)過500目篩，留在500目篩上的細(xì)胞團(tuán)用細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗下來，制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)板中就可進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)[21-22]。用這種方法可以很有效地去除大量成纖維細(xì)胞和難以貼壁增殖的單個腸上皮細(xì)胞，最終留在細(xì)胞懸液中大部分為腸上皮細(xì)胞團(tuán)。本研究采用了150～500目細(xì)胞篩連續(xù)過濾的方法進(jìn)行去除成纖維細(xì)胞，獲得大量十二指腸上皮細(xì)胞團(tuán)，并經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及堿性磷酸酶染色鑒定，很少有成纖維細(xì)胞、血細(xì)胞等雜細(xì)胞污染，細(xì)胞純化較為徹底。

目前，鑒定小腸上皮細(xì)胞的常用方法有形態(tài)學(xué)鑒定、堿性磷酸酶染色法、免疫細(xì)胞化學(xué)法等[23-25]。本試驗(yàn)的十二指腸上皮細(xì)胞增殖迅速，在培養(yǎng)的2～3 d數(shù)量顯著增多，形成集落，呈單層“鋪路石樣”生長，邊界清晰，互不重疊，多呈扁平多角狀、卵石狀、橢圓狀，符合原代培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)特征。然而，僅憑在顯微鏡下觀察具有腸上皮細(xì)胞特征的細(xì)胞不能確定為小腸上皮細(xì)胞，只能確定為類腸上皮細(xì)胞，還需要進(jìn)一步鑒定。堿性磷酸酶是小腸上皮細(xì)胞微絨毛上的標(biāo)志性酶[2,24]，該酶凝集于腸細(xì)胞表面，參與細(xì)胞內(nèi)消化及上皮細(xì)胞脫落到腸腔內(nèi)的細(xì)胞外消化過程，能被成功染色的細(xì)胞即為十二指腸上皮細(xì)胞。洪智敏等[2]、楊文平等[26]和賈國東等[9]均采用堿性磷酸酶染色鑒定法成功鑒定十二指腸上皮細(xì)胞。

Caco-2細(xì)胞單層的緊密連接性一般用細(xì)胞TEER值和標(biāo)志物的表觀通透系數(shù)來評價。其中TEER值測定是目前公認(rèn)的一種簡單而權(quán)威性的評價方法，細(xì)胞層的緊密連接與TEER值具有密切相關(guān)，當(dāng)TEER值增長到一定水平(通常為大于300 Ω·cm2)后即表明細(xì)胞單層的緊密連接性好[27]。TEER值越大，說明細(xì)胞緊密連接越強(qiáng)[28-31]。酚紅為水溶性小分子物質(zhì)，不易被腸黏膜代謝且不會通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，可以間接反映單層細(xì)胞之間連接處的通透量，作為細(xì)胞單層連接緊密性的標(biāo)示物。因此，本試驗(yàn)采用酚紅作為探針評價在Transwell 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的插槽內(nèi)培養(yǎng)的十二指腸上皮細(xì)胞間連接的緊密性，酚紅透過率小于5%作為細(xì)胞單層形成的標(biāo)志[30]。在本試驗(yàn)中細(xì)胞培養(yǎng)的24、48和72 h，Ⅰ組和Ⅱ組細(xì)胞的TEER值均滿足大于300 Ω·cm2的試驗(yàn)要求，酚紅透過率均滿足小于5%的試驗(yàn)要求，并且2組細(xì)胞的TEER值在48 h均達(dá)到最高狀態(tài)并持續(xù)到72 h，另外，Ⅰ組細(xì)胞的TEER值均大于Ⅱ組，細(xì)胞酚紅透過率均小于Ⅱ組，說明Ⅰ組已貼壁的十二指腸上皮細(xì)胞間緊密連接性更強(qiáng)。由此可見，細(xì)胞TEER值、酚紅透過率也可以作為評估原代培養(yǎng)十二指腸上皮細(xì)胞緊密連接性的指標(biāo)。

LDH是機(jī)體細(xì)胞內(nèi)一種穩(wěn)定存在的酶，當(dāng)細(xì)胞膜受到損害時，它就會通過細(xì)胞膜從細(xì)胞內(nèi)漏出到細(xì)胞外，因此，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力的高低在一定程度上反映了細(xì)胞的損傷程度[32-34]。Qin等[18]通過測定原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力，來作為判斷熱應(yīng)激心肌細(xì)胞損傷的標(biāo)志。所以，本試驗(yàn)通過測定十二指腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力來間接反映十二指腸上皮細(xì)胞膜的完整性及細(xì)胞活力。本試驗(yàn)中Ⅰ組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力在細(xì)胞培養(yǎng)的24、48、72 h均維持在較低的水平，在細(xì)胞培養(yǎng)的96 h開始顯著升高，而其他2組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力在72 h就已經(jīng)明顯升高，表明Ⅰ組已貼壁的十二指腸上皮細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)的24、48和72 h生長狀態(tài)最好、活力最佳。

4 結(jié) 論

綜合以上細(xì)胞形態(tài)學(xué)、TEER值、酚紅透過率、細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力4項(xiàng)指標(biāo)得出，在細(xì)胞培養(yǎng)的48 h，2.90×106個/mL細(xì)胞密度組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞之間界限清晰、緊密連接性強(qiáng)，細(xì)胞活力最佳，因此，原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞的物質(zhì)吸收模型構(gòu)建成功，并且該組細(xì)胞所用的接種密度(2.90×106個/mL)可以作為后續(xù)十二指腸上皮細(xì)胞的吸收規(guī)律及其分子機(jī)制的研究試驗(yàn)中所用的細(xì)胞接種密度。