高秀飛 劉 培 葛玉清

浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

華佗在《中藏經(jīng)》中提出：“夫癰疽瘡腫之所作也，皆五臟六府蓄毒不流則生矣，非獨因榮衛(wèi)壅塞而發(fā)者也?！薄芭K腑蓄毒不化”可能是產(chǎn)生腫瘤的原因。由此，乳腺癌的發(fā)生是在“蓄毒”病因的長期刺激下導致“臟腑蓄毒不化”而致“癌毒內生”的過程?！靶疃尽辈粌H可以影響臟腑氣血，導致臟腑失調，影響氣血津液的運行，導致痰、瘀內生。痰、瘀、毒相互影響、轉化，三者膠著，共同促進了乳腺癌的發(fā)展。本實驗以化瘀的莪術為對照，觀察化痰的蛇六谷對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞裸鼠肺轉移的影響，為中醫(yī)藥抗乳腺癌“痰、瘀、毒”理論提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要試劑與儀器：RRPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清為美國GIBCO公司產(chǎn)品，CCK-8 Kit（細胞計數(shù)CCK8試劑盒）為日本DOJINDO公司產(chǎn)品、二甲基亞砜（DMSO）為SIGMA公司產(chǎn)品。潔凈工作臺（上海凈化設備廠），CO2培養(yǎng)箱（SANYO，日本）。乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純。生物發(fā)光成像儀（XGI-8 Gas Anesthesia System）Matrigel basement membrane matrix(BD公司產(chǎn)品)，醫(yī)用顯微鏡(Nikon，日本)，血球計數(shù)板，BX60顯微鏡（Olympus，日本），Chemilmayer 5500/Spectralmayer 5000顯微彩色圖像分析系統(tǒng)（安萊生命科技有限公司）。DEPC(Sigma),TRIzol（Gibco BRL）；Super-Script反轉錄酶及其緩沖液（Gibco BRL）；Taq DNA聚合酶及其緩沖液（Roche）；dNTP(Roche)；目的基因引物及探針：Takara公司合成。

1.2 細胞：人三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231由浙江省醫(yī)學科學院腫瘤研究所惠贈。用10%胎牛血清和10ug/ml人胰島素的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)備用。構建表達GFP-熒光素酶標記的MDA-MB-231亞細胞系MDA-MB-231-GFP：取經(jīng)過五次傳代的MDAMB-231細胞，用0.125%的胰蛋白酶消化后，吹打使其分散；4℃離心1000rpm/min、5min，吸走上清，再用無菌PBS洗滌2次；用細胞培養(yǎng)液重懸細胞，以每孔2×104個細胞/500μl接種24孔板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞融合率為60%～70%且狀態(tài)良好時用于慢病毒感染。在感染前將培養(yǎng)基換成低血清的培養(yǎng)基，將已制備好的慢病毒液分別吸取200、100、50μl至3個不同的孔中，并加入polybrene，使其終濃度為10μg/ml。24小時后，換成不含polybrene的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 動物：BALB/c裸鼠70只，均為雌性，4周齡，從上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司購買（生產(chǎn)許可證：SCXK滬2012-00002），飼養(yǎng)條件為SPF級。

1.4 藥物：蛇六谷由浙江省中醫(yī)院中藥房提供，產(chǎn)地臨安，批號201206；莪術由浙江省中醫(yī)院中藥房提供，產(chǎn)地廣西，批號201209：表阿霉素由輝瑞制藥（無錫）有限公司生產(chǎn)，批號H200000497；生理鹽水由上海信誼金朱藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號120701。

2 方法

2.1 建立動物模型：將MDA-MB-231-GFP細胞培養(yǎng)，待其生長狀態(tài)良好時，消化離心后計數(shù)并調整細胞懸液的細胞濃度為2×107個/ml。無菌條件下，用4%水合氯醛按10μl/g將裸鼠常規(guī)麻醉后，以每只0.2ml尾靜脈注射建立裸鼠乳腺癌血液傳播模型。

2.2 給藥：將裸鼠隨機分為6組（A/B/C/D/E/F組），每組10只。注射細胞后3天后進行藥物干預：A組：中藥蛇六谷水提物組；B組：蛇六谷石油醚提取物組；C組：中藥莪術水提物組；D組：莪術石油醚提取物組；E組：表阿霉素組；F組：生理鹽水組。給藥劑量按照人鼠等效劑量公式dA＝dB×(RA/RB)×（WB/WA）1/3進行劑量換算，其中成人體重以60kg計算，裸鼠體重以20g計算。莪術和蛇六谷水提物和石油醚提取物每日灌胃：臨床劑量每日30g，人每日臨床劑量30g/60kg=0.5g/kg；小鼠每日劑量為人臨床劑量20倍，每只小鼠10g/kg×0.02=0.2g，濃度設為1g生藥/ml，0.2ml/只/天。表阿霉素每周尾靜脈注射：臨床用量每3周1次，每次60mg/m2，每周20mg/m2，每周用量為：0.5mg/kg。小鼠每日劑量為人臨床劑量10倍，每只小鼠5mg/kg×0.02=0.1mg，濃度設為0.5mg/ml，0.2ml/只/周。100mlGS+50mg的表阿霉素配置。

2.3 檢測項目：分述如下。

2.3.1 熒光生物成像：用生物發(fā)光成像儀體外觀察裸鼠體內腫瘤細胞轉移情況，檢測裸鼠的肺是否存在轉移灶。腹腔內注射0.2mlGFP-熒光素酶標記的MDA-MB-231的底物，10min后放入異氟醚麻醉箱麻醉，采用生物發(fā)光成像儀（XGI-8 Gas Anesthesia System，圖1）測量（在浙江理工大學生命科學院檢測），LuminaⅡ Living Image 4.2分析。

圖1 生物發(fā)光成像儀

2.3.2 測肺重：在藥物干預后的第4周，每組脫頸處死裸鼠5只，解剖觀察有無肺轉移。取出肺等組織，用電子天平稱重。切取部分腫瘤組織0.5cm×0.5cm×0.5cm大小進行石蠟包埋切片，部分腫瘤組織剪碎，液氮保存。計算肺轉移增重率，計算公式如下：增重率(%)=［（實驗組平均肺重-空白對照組平均肺重）/空白對照組平均肺重］×100%；在藥物干預后的第5周，實驗結束，脫頸處死所有裸鼠，解剖觀察有無肺轉移。取出肺等組織，稱重；切取部分腫瘤組織進行石蠟包埋切片，部分腫瘤組織剪碎，液氮保存。

2.3.3 Western Blot檢測肺組織的粘附因子E-cadherin、E-selectin和趨化因子CCR7、SDF-1、CXCR4蛋白表達：提取各轉移灶組織中的蛋白質，將組織在液氮中碾碎后，轉移至勻漿器中；在預冷的細胞裂解液中添加PMSF/異丙醇儲備液并加入到勻漿器中，冰浴條件下充分研磨后轉移至無菌1.5ml的離心管中，離心后轉移上清液至一新的1.5ml離心管中，即為組織蛋白提取液。BCA定量法測定提取液中蛋白質濃度后即可進行蛋白質印跡。檢測各轉移灶組織中E-cadherin、E-selectin、CCR7、SLC、SDF-1、CXCR4的蛋白質表達量。

2.3.4 Real-time PCR方法檢測肺組織的粘附因子E-cadherin、E-selectin 和趨化因子 CCR7、SLC、SDF-1、CXCR4基因表達：提取各轉移灶組織的RNA：在液氮中將組織在預冷的研缽中研碎，待研磨成粉末狀后轉移至玻璃勻漿器中，加入適量的Trizol，冰浴條件下輕輕充分研磨，待液體澄清后轉移至無菌1.5ml的離心管中。按照Trizol提取RNA方法，依次加入氯仿分層、異丙醇抽提RNA、75%無水乙醇洗滌后，用DEPC水溶解RNA沉淀，測定濃度及OD值。檢測各轉移灶組織中E-cadherin、E-selectin、CCR7、SLC、SDF-1、CXCR4的mRNA表達量。

3 結果

3.1 熒光生物成像：從生物發(fā)光成像儀體外觀察裸鼠體內腫瘤細胞轉移情況,經(jīng)尾靜脈注射MDA-MB-231-GFP細胞后各藥物干預4周后觀察到：各組模型中均可見乳腺癌肺轉移，蛇六谷水提物組、莪術石油醚提取物組能明顯抑制MDA-MB-231-GFP經(jīng)血液傳播轉移程度。見圖2。

圖2 各組藥物干預4周后的尾靜脈注射MDA-MB-231-GFP裸鼠熒光成像

經(jīng)尾靜脈注射MDA-MB-231-GFP細胞后各藥物干預5周后觀察到：蛇六谷水提物組、蛇六谷石油醚提取物組、莪術石油醚提取物組、表阿霉素組能明顯抑制MDAMB-231-GFP經(jīng)血液傳播轉移程度。見圖3。

圖3 各組藥物干預5周后的尾靜脈注射MDA-MB-231-GFP裸鼠熒光成像

3.2 測體重和肺重：采用多樣本均數(shù)間比較的單因素方差分析，方差齊性檢驗，P=0.079，提示方差齊，采用LSD法，結果顯示實驗前BALB/c裸鼠各組間體重差異無統(tǒng)計學意義，排除體重對實驗結果的影響。見表1。

表1 各實驗組BALB/c裸鼠實驗前體重（±s，g）

表1 各實驗組BALB/c裸鼠實驗前體重（±s，g）

實驗前體重19.81±1.76 22.39±1.14 19.06±3.70 19.49±1.57 18.00±1.31 20.46±1.39組別蛇六谷水提物組蛇六谷石油醚提取物組中藥莪術水提物組莪術石油醚提取物組表阿霉素組生理鹽水組樣本數(shù)10 10 10 10 10 10

采用多樣本均數(shù)間比較的單因素方差分析，方差齊性檢驗，P=0.168，提示方差齊，采用LSD法，結果顯示在造模后連續(xù)給藥5周后，各組體重都降低，降低后的體重各組間的差異無統(tǒng)計學意義。見表2。各實驗組各自治療前后量表自身對照結果，組內配對t檢驗比較均P＞0.05，體重降低無統(tǒng)計學意義。

表2 各實驗組BALB/c裸鼠實驗后體重（±s，g）

表2 各實驗組BALB/c裸鼠實驗后體重（±s，g）

稱重17.80±2.86 21.48±0.51 18.60±2.46 17.72±1.44 17.84±3.18 19.90±2.27組別蛇六谷水提物組蛇六谷石油醚提取物組中藥莪術水提物組莪術石油醚提取物組表阿霉素組生理鹽水組樣本數(shù)10 10 10 10 10 10

在藥物干預后的第4周，每組脫頸處死裸鼠5只，取出肺等組織，用電子天平稱重，計算肺組織增重率，計算公式如下：增重率(%)=［（實驗組平均肺重-空白對照組平均肺重）/空白對照組平均肺重］×100%；表阿霉素肺增重不明顯，蛇六谷和莪術肺增重均明顯，其中蛇六谷石油醚提取物組肺增重最少（21%），結果如表3。

表3 各實驗組BALB/c裸鼠給藥4周肺增重率

在藥物干預后的第5周，每組脫頸處死裸鼠，取出肺等組織，用電子天平稱重，計算肺組織轉移增重率，各組的肺組織與生理鹽水組比較，均增重明顯。表阿霉素肺組織增重最低，抑制肺轉移作用最強；蛇六谷和莪術肺增重均明顯，其中蛇六谷石油醚提取物組肺增重最少（18%），結果如表4。

表4 各實驗組BALB/c裸鼠給藥5周肺增重率

3.3 Western Blot檢測肺組織的粘附因子E-cadherin、E-selectin和趨化因子CCR7、SDF-1、CXCR4蛋白表達：結果顯示，與生理鹽水組對比，各組藥物均降低了E-cadherin、CCR7蛋白表達；蛇六谷水提取上調E-selectin、CXCR4蛋白表達；蛇六谷石油醚和莪術石油醚提取物提取物上調SDF-1、CCL21蛋白表達，且蛇六谷石油醚作用強于莪術石油醚提取物（P＜0.05）。表阿霉素作用均為下調粘附因子和趨化因子的蛋白表達。見圖4、5。

圖4 各藥物對肺組織中粘附因子、趨化因子蛋白表達的影響

圖5 各藥物對肺組織中粘附因子、趨化因子蛋白表達的影響

3.4 Real-time PCR方法檢測肺組織的粘附因子E-cadherin、E-selectin 和趨化因子 CCR7、SLC、SDF-1、CXCR4基因表達：結果顯示，與生理鹽水組比較，蛇六谷水提物、蛇六谷石油醚提取物均可顯著提高細胞內粘附因子 E-cadherin、E-selectin、CCR7 mRNA表達（P＜0.05），莪術石油醚提取物下調E-cadherin、E-selectin、CCR7 mRNA表達；蛇六谷水提物、莪術石油醚提取物提高CXCR4 mRNA的表達，且蛇六谷水提取作用強于莪術石油醚提取物（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各藥物對肺組織中粘附因子、趨化因子mRNA表達的影響

4 討論

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）在乳腺癌中約占15～20%，該類型乳腺癌所表達的雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長因子受體2（Her-2）均為陰性，因其靶受體的喪失，三陰性乳腺癌患者不能受益于基于激素或曲妥珠單抗的靶向治療[1]。故化療仍然是該類型乳腺癌早晚期主要治療方法[2]。盡管三陰性乳腺癌患者對化療藥物如紫杉烷類和蒽環(huán)類藥物的初始反應優(yōu)于其他乳腺癌亞型，但因其較易形成耐藥且病情進展快速，預后仍然很差[1，3]。

中醫(yī)藥由于具有辨證論治的特點，符合腫瘤個體化治療的要求，有助于減輕放、化療的毒副反應，可以達到抗轉移防復發(fā)、提高生活質量、延長生存期、提高生存率的目的。近年來，中醫(yī)藥在預防乳腺癌根治術后的復發(fā)以及治療并發(fā)癥方面起到了顯著的作用。在三陰性乳腺癌治療上，中醫(yī)藥能提高患者免疫力和降低復發(fā)轉移[4-6]。

既往研究蛇六谷和莪術均能抑制三陰性乳腺癌細胞株的增殖作用[7-8]，本研究結果證實蛇六谷和莪術抗三陰性乳腺癌肺轉移的作用，活血化痰解毒中藥抑制乳腺癌肺轉移，通過“以藥測證”演繹“以方測證”，提示了乳腺癌肺轉移“痰、瘀、毒”理論。其中化痰解毒的蛇六谷水提物作用較活血解毒的莪術強，這也同樣提示乳腺癌肺轉移痰毒最甚。蛇六谷、莪術對粘附因子和趨化因子基因和蛋白表達上不平衡，這是因為中藥成分復雜，抗腫瘤作用機理是多靶點的，對三陰性乳腺癌作用的信號特異性轉導通路、血管生成等方面影響諸多。蛇六谷抗腫瘤轉移的臨床和實驗研究較多[9]，針對中藥對腫瘤復發(fā)轉移的機理研究還有待于深入、細致的研究。諸類研究為今后治療三陰性乳腺癌的臨床藥物應用提供試驗依據(jù)和理論基礎。