趙文慧 馬津真 聶曉靜 吳 悅 陳 宇 陳 璇 吳人照#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053 2 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

我國(guó)高血壓病患病率為29.6%[1]。高血壓病是引起諸如中風(fēng)、心肌梗死、心衰等疾病的重要危險(xiǎn)因素之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的降壓治療均為對(duì)癥治療，目前常用的降壓藥包括鈣離子通道阻滯劑（CCB）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（ARB）、利尿劑和β阻滯劑5種[2]，尚不能完全阻止高血壓病以及其繼發(fā)病變的進(jìn)展，大多數(shù)高血壓患者需要2種或2種以上的降壓藥方可達(dá)到目標(biāo)血壓[3]。多數(shù)患者需要終身服藥，因長(zhǎng)療程用藥而藥物療效逐漸降低，產(chǎn)生毒副作用，還有隨著壽命的延長(zhǎng)而這些問(wèn)題更加突出。目前高血壓治療依然需要深入研究和完善，中醫(yī)藥對(duì)于體質(zhì)和血壓的調(diào)節(jié)作用，具有整體調(diào)理的優(yōu)勢(shì)。鐵皮石斛乙醇提取物對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）血壓的影響尚未發(fā)現(xiàn)有研究，為充分利用鐵皮石斛資源，尋找更有效的鐵皮石斛降壓用法，本實(shí)驗(yàn)研究鐵皮石斛醇提取物的降血壓作用，并探索其降壓機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：10周齡SHR大鼠24只，Wistar大鼠8只，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證：SCXK(京)2016-0011。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：鐵皮石斛藥材批號(hào)：160509，購(gòu)自華東醫(yī)藥股份有限公司。鐵皮石斛醇提取樣品：加5倍總生藥量的75%乙醇55～60℃浸提24小時(shí)，提取2次，合并提取物，濃縮，滅菌。對(duì)照藥品：絡(luò)活喜（苯磺酸氨氯地平片），5mg/片，批號(hào)：R78401，輝瑞制藥。

1.3 主要試劑：RNAisoPlus9109：批號(hào)：AKA6402，PrimeScript? RT Master Mix（Perfect Real Time）RR036A：批 號(hào) ：AK5101，SYBR? Premix Ex Taq? II(Tli RNaseH Plus)RR820A：批號(hào)：AK9301，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，激素檢測(cè)試劑：天津博奧賽斯高血壓系列。

1.4 主要儀器：無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)xBP-98A型，日本軟融株式會(huì)社；DK-S型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD凈化工作臺(tái)：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；PCR儀：美國(guó)ABI Veriti；熒光定量PCR儀：美國(guó)ABI StepOnePlus；核酸蛋白質(zhì)定量?jī)x：美國(guó)Thermofisher NanoDrop 2000。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后測(cè)量血壓及體重，隨機(jī)將24只SHR大鼠分為3組：鐵皮石斛醇提物組(0.8g/kg·d）、絡(luò)活喜組(0.5mg/kg·d)、模型組、每組8只，雌雄各半。正常Wistar大鼠8只為正常對(duì)照組，雌雄各半。各組大鼠灌胃容量為1.33ml/100g體重，正常對(duì)照組和模型組均灌胃等量飲用水。實(shí)驗(yàn)療程8周，每周測(cè)量1次給藥2小時(shí)及24小時(shí)血壓，觀(guān)察收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）的1天中的波動(dòng)變化。

1.6 血壓的測(cè)量：將大鼠38℃預(yù)熱5～10min，將BP-98A型無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x的加壓感應(yīng)器放在大鼠尾根部，并通過(guò)配套軟件獲取數(shù)據(jù)。每只大鼠清醒安靜時(shí)測(cè)量3次，均值為測(cè)量值。

1.7 相關(guān)mRNA的表達(dá)量檢測(cè)：大鼠4只/組麻醉處死后取腎臟組織，置于液氮中速凍后-80℃保存。用于檢測(cè)組織mRNA的表達(dá)。使用試劑RNAisoPlus9109提取總RNA，測(cè)量濃度和OD260/OD280。用試劑盒PrimeScript? RT Master Mix（Perfect Real Time）RR036A進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物稀釋5倍后用于qPCR。用試劑盒SYBR?Premix Ex Taq? II(Tli RNaseH Plus)RR820A檢測(cè)腎臟血管緊張素Ⅱ1型受體（Angiotensin II Type I Receptors，AT1R）、內(nèi)皮素(endothelin-1，ET-1)mRNA的表達(dá)量，內(nèi)參引物為β-actin。基因的引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因的引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)資料用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用單因素方差分析（ANOVA），以及LSD-t和Dunnett T3檢驗(yàn)方法；數(shù)據(jù)描述以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05和（或）P＜0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 鐵皮石斛醇提取物對(duì)SHR大鼠血壓的影響：治療前鐵皮石斛醇提物組、絡(luò)活喜組與模型組血壓無(wú)顯著差異（P＞0.05），組間有可比性；正常對(duì)照組大鼠血壓低于同期各組，差異顯著（P＜0.01）。

2.1.1 對(duì)收縮壓（SBP）的影響：兩個(gè)治療組給藥后2小時(shí)SBP從第1次治療到治療8周，均顯著低于同期模型組（P＜0.01）。在治療8周、停藥3天，兩個(gè)治療組給藥后24小時(shí)SBP均顯著低于模型組（P＜0.01）。鐵皮石斛醇提物(0.8g/kg·d)的給藥后2小時(shí)、24小時(shí)SBP降壓作用與絡(luò)活喜相近。數(shù)據(jù)見(jiàn)表2、表3。

2.1.2 對(duì)舒張壓（DBP）的影響：兩個(gè)治療組給藥后2小時(shí)DBP從第1次治療到治療8周，均顯著低于同期模型組（P＜0.01）。在治療8周及停藥3天，兩個(gè)治療組給藥后24小時(shí)DBP均顯著低于模型組（P＜0.01）；在治療完成停藥3天，鐵皮石斛醇提物組給藥后24小時(shí)DBP顯著低于絡(luò)活喜組（P＜0.05）。鐵皮石斛醇提物(0.8g/kg·d)的給藥后2小時(shí)、24小時(shí)DBP降壓作用與絡(luò)活喜相近，部分時(shí)間點(diǎn)的降壓作用還顯著高于絡(luò)活喜。數(shù)據(jù)見(jiàn)表4、表5。

表2 鐵皮石斛醇提取物對(duì)大鼠給藥2小時(shí)SBP的影響（±s，mmHg）

表2 鐵皮石斛醇提取物對(duì)大鼠給藥2小時(shí)SBP的影響（±s，mmHg）

注：與模型組比較，▲P＜0.01；與絡(luò)活喜組比較，●P＜0.01。

療 程正常組例數(shù) 鐵皮石斛醇提組 絡(luò)活喜組 模型組治療前第1次治療治療4周治療8周141.29±3.44▲●140.25±3.51▲●139.21±3.37▲●143.54±3.62▲●8 8 8 8 207.36±6.66 179.54±2.93▲181.58±4.39▲178.00±4.42▲209.75±8.92 181.13±7.38▲175.67±5.54▲178.13±2.86▲208.42±8.80 205.21±10.58●210.17± 7.15●212.33± 5.75●

表3 鐵皮石斛醇提取物對(duì)大鼠給藥24小時(shí)SBP的影響（±s，mmHg）

表3 鐵皮石斛醇提取物對(duì)大鼠給藥24小時(shí)SBP的影響（±s，mmHg）

注：與模型組比較，▲P＜0.01；與絡(luò)活喜組比較，●P＜0.01。

療 程正常組例數(shù) 鐵皮石斛醇提組 絡(luò)活喜組 模型組治療前第1次治療治療4周治療8周停藥3天141.29±3.44▲●139.38±4.23▲●139.54±3.38▲●141.83±2.58▲●142.17±2.48▲●8 8 8 8 4 207.36±6.66 207.58±5.23 207.08±6.73 202.00±4.39▲202.08±1.40▲209.75±8.92 203.71±9.18 208.96±7.09 201.96±5.88▲205.42±1.85▲208.42±8.80 205.67±7.52 211.04±9.15 216.96±6.39●214.17±3.57●

表4 鐵皮石斛醇提取物對(duì)大鼠給藥2小時(shí)DBP的影響（±s，mmHg）

表4 鐵皮石斛醇提取物對(duì)大鼠給藥2小時(shí)DBP的影響（±s，mmHg）

注：與模型組比較，▲P＜0.01；與絡(luò)活喜組比較，●P＜0.01。

療 程模型組例數(shù) 鐵皮石斛醇提組 絡(luò)活喜組正常組治療前第1次治療治療4周治療8周157.13±6.72 156.42±3.64 163.88±7.88●159.71±5.86▲●8 8 8 8 157.35±6.36 142.83± 4.47▲141.50±13.07▲141.67± 2.05▲156.03±4.47 143.33±10.97▲146.21± 8.50▲144.71± 3.66▲103.56±7.50▲●106.75±4.98▲●101.25±2.82▲●100.75±4.57▲●

表5 鐵皮石斛醇提取物對(duì)大鼠給藥24小時(shí)DBP的影響（±s，mmHg）

表5 鐵皮石斛醇提取物對(duì)大鼠給藥24小時(shí)DBP的影響（±s，mmHg）

注：與模型組比較，▲P＜0.01；與絡(luò)活喜組比較，○P＜0.05，●P＜0.01。

療 程模型組例數(shù) 鐵皮石斛醇提組 絡(luò)活喜組正常組治療前第1次治療治療4周治療8周停藥3天157.13±6.72 162.83±8.61 164.13±6.11 165.38±4.16●165.92±5.50○8 8 8 8 4 157.35±6.36 158.38±6.95 158.71±6.11 156.04±8.39▲149.58±3.45▲○156.03±4.47 158.88±8.34 161.25±7.00 154.33±5.50▲158.67±2.79▲103.56±7.50▲●104.96±6.41▲●102.29±5.30▲●107.54±4.87▲●101.75±7.03▲●

表6 腎臟AT1R、ET-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（±s）

表6 腎臟AT1R、ET-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；與絡(luò)活喜組比較，○P＜0.05，●P＜0.01。

ET-1mRNA 0.000718±0.000116▲○0.001097±0.000242 0.001287±0.000241 0.000944±0.000101△分組鐵皮石斛醇提組絡(luò)活喜組模型組正常組AT1RmRNA 0.020360±0.002184△●0.004760±0.001083▲0.016201±0.001676●0.013121±0.002459●

2.2 鐵皮石斛醇提取物對(duì)AT1R、ET-1mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響：如表6所示：模型組AT1R mRNA表達(dá)高于正常組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），鐵皮石斛醇提物組AT1R mRNA表達(dá)顯著高于模型組（P＜0.01）；絡(luò)活喜AT1R mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組（P＜0.01）；模型組ET-1 mRNA表達(dá)顯著高于正常組（P＜0.05），鐵皮石斛醇提物組ET-1 mRNA表達(dá)顯著低于模型組（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步說(shuō)明，鐵皮石斛醇提物下調(diào)了ET-1 mRNA表達(dá)，上調(diào)了AT1R mRNA表達(dá)。

3 討論

高血壓病屬中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”范圍，病因多與陰虛陽(yáng)亢有關(guān)，治療原則為滋陰潛陽(yáng)。鐵皮石斛性微寒，具有滋陰清熱作用。有研究表明，鐵皮石斛水提取物對(duì)易卒中型自發(fā)性高血壓大鼠具有持久的降血壓作用，可有效提高生存率，預(yù)防中風(fēng)[4-6]。有文獻(xiàn)報(bào)告，不同濃度的石斛乙醇提取物對(duì)豚鼠正常血壓有顯著的降血壓作用[7]，但該文獻(xiàn)未報(bào)告對(duì)高血壓的治療作用。本研究表明，鐵皮石斛醇提取物可顯著降低SHR大鼠血壓，降壓作用達(dá)到了與西藥絡(luò)活喜相近，部分時(shí)間點(diǎn)的給藥后24小時(shí)舒張壓低于西藥絡(luò)活喜，說(shuō)明鐵皮石斛醇提取物降壓比西藥絡(luò)活喜降壓更穩(wěn)定。

鐵皮石斛醇提物上調(diào)腎臟AT1R mRNA表達(dá)，下調(diào)腎臟ET-1 mRNA的表達(dá)。其中下調(diào)腎臟ET-1 mRNA的表達(dá)可能與其降壓作用機(jī)制有關(guān)。