翁思穎 王 磊 柴可夫#

1 浙江省寧波市中醫(yī)院 浙江 寧波 315010 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

糖尿病腎病(DN)是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥，由此導(dǎo)致的終末期腎病已成為糖尿病患者死亡主因。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病血管病變存在“代謝記憶”效應(yīng)[1]。若前期血糖控制不佳，即使后期血糖控制良好，血管病變發(fā)生率仍高于長期血糖控制良好者[2]。而沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)可通過對腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性的調(diào)節(jié)，降低還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶水平、減少活性氧(ROS)積累、減輕高糖引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)、減少腎損傷[3]。益氣養(yǎng)陰活血湯是本團隊基于對DN“氣陰不足、陰虛耗津、煉津成瘀”的病機所形成的經(jīng)驗方。團隊前期研究發(fā)現(xiàn)由該方所制的糖腎顆?？筛纳艱N大鼠腎臟內(nèi)皮細(xì)胞功能、降低糖基化終末產(chǎn)物及其受體的表達[4-5]。故本研究擬通過建立人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)短暫高糖腎損傷模型，從Sirt1/AMPK通路途徑探討益氣養(yǎng)陰活血湯緩解短暫高糖“代謝記憶”效應(yīng)導(dǎo)致腎損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料：人腎小管上皮HK-2細(xì)胞株購于中國科學(xué)院典藏細(xì)胞庫。低糖DMEM/F-12培養(yǎng)液(CORNING)、胎牛血清(Gibco)、青霉素/鏈霉素溶液(Gibco)、50%葡萄糖注射液(中南科倫)；小鼠單克隆抗SIRT1抗體(abcam)、兔單克隆抗AMPK-α2/phospho S491抗體(abcam)，兔單克隆抗AMPK-α2抗體(abcam)，兔單克隆抗p67phox抗體(abcam)，二抗山羊抗小鼠IgG抗體、山羊抗兔IgG抗體(中杉金橋)、抗GAPDH抗體(abcam,ab8245)；PVDF轉(zhuǎn)印膜(Millipore)；紫外分光光度計(Beckman)，Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng)，Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad)，凍干機(CHRIST)。

1.2 實驗藥物制備：益氣養(yǎng)陰活血湯凍干粉制備：生黃芪、女貞子、葛根各30g，丹參20g，制大黃5g。藥材由浙江省中藥研究所制劑室提供，藥材粉碎后加5倍水煎煮1h，煎次，合并濾液后調(diào)整pH值至7，濃縮定容至生藥含量2g/ml，微孔濾膜過濾除菌后，將藥液加入8%甘露醇，置于凍干箱中，測定共熔點為-9℃，在冷凍機中-50℃預(yù)凍4h，并由-20℃低溫干燥升華12h，32℃解析干燥8h后完成制備，4℃冷藏備用，使用時以對應(yīng)培養(yǎng)基溶解至需要濃度，對照組細(xì)胞加入等量對應(yīng)培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞造模及實驗分組：將HK-2細(xì)胞系接種于DMEM/F-12培養(yǎng)基(50/50Mix,5.6mmol/l葡萄糖)中，加入10%胎牛血清與1%青/鏈霉素，5%CO2、37℃、飽和濕度下培養(yǎng)。參照文獻[6-7]方法，將第三代細(xì)胞以50mmol/L葡萄糖的高糖培養(yǎng)基(由5.6mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基+50%葡萄糖注射液配置)干預(yù)16h，建立高糖損傷模型，設(shè)為高糖組(HG)；同時將正常HK-2細(xì)胞以低糖培養(yǎng)基(5.6mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)16h，設(shè)立低糖組(LG)。將高糖培養(yǎng)16h的成模細(xì)胞更換低糖培養(yǎng)基，干預(yù)48h，建立短暫高糖組(HG+LG)；另以成模細(xì)胞更換低糖培養(yǎng)基，并加入益氣養(yǎng)陰活血湯凍干粉干預(yù)48h，設(shè)立短暫高糖+TD組(HG+LG/TD)。

1.4 DCF法測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平：將種植于96孔板內(nèi)的細(xì)胞去除培養(yǎng)基后，以無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA至10μmol/L，每孔加入100μl含DCFH-DA培養(yǎng)基，37℃孵育30min后，去除含DCFH-DA培養(yǎng)基，以無血清培養(yǎng)基及PBS漂洗后，每孔加入PBS 200μl。激光共聚焦顯微鏡下觀察ROS熒光強度，酶標(biāo)儀以激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm測定熒光強度。

1.5 Western Blot法測定HK-2細(xì)胞Sirt1、NADPH氧化酶亞基p67phox蛋白表達量及AMPK-α2磷酸化程度：將細(xì)胞加入RIPA蛋白裂解液后提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，行SDS-PAGE電泳分析，電泳(80V/20min，轉(zhuǎn)120V/40min)后行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜(恒流，200Ma，105min)，結(jié)束后5%脫脂奶粉室溫封閉1h。以封閉液1：1000稀釋一抗后，4℃孵育過夜。二抗室溫孵育1h。Image J軟件分析光密度值，分別測Sirt1、AMPK-α2、pAMPK-α2、p67phox蛋白的表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以(mean±SD)表示，多組間比較采取單因素方差分析，若方差齊則采取L-S-D檢驗，方差不齊則采用Dunnett’T3檢驗；以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 短暫高糖對HK-2細(xì)胞ROS水平的影響及益氣活血養(yǎng)陰湯干預(yù)作用：DCF法測各組細(xì)胞ROS水平。發(fā)現(xiàn)HG組、HG+LG組與LG組相比，ROS水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；HG+LG組與HG組相比，ROS水平無變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；HG+LG/TD組與HG組相比，ROS水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。表明高糖可使HK-2細(xì)胞ROS水平升高，將高糖環(huán)境改為低糖環(huán)境不能使ROS水平改變，而在此基礎(chǔ)上加用益氣養(yǎng)陰活血湯則可降低ROS水平。見圖1。

2.2 短暫高糖對HK-2細(xì)胞Sirt1、p67phox蛋白表達及AMPK-α2磷酸化程度的影響及益氣活血養(yǎng)陰湯干預(yù)作用：Western blot法測各組HK-2細(xì)胞Sirt1、p67phox蛋白表達及AMPK-α2磷酸化程度。發(fā)現(xiàn)HG組、HG+LG組與LG組相比，Sirt1水平、pAMPK-α2/AMPK-α2比例均下降，p67phox水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；HG+LG組與HG組相比，Sirt1、pAMPK-α2/AMPK-α2、p67phox水平均無變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；HG+LG/TD組與HG組相比，Sirt1、pAMPK-α2/AMPK-α2比例升高，p67phox水平均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。說明高糖可下調(diào)HK-2細(xì)胞Sirt1蛋白表達、抑制AMPK-α2磷酸化程度減少其活性，以上調(diào)NADPH氧化酶亞基p67phox表達增加其活性；將高糖環(huán)境改為低糖后，這種改變將得以持續(xù)；而在改為低糖環(huán)境后同時加用益氣化濁湯干預(yù)，則可上調(diào)Sirt1表達，升高AMPK-α2磷酸化水平、增強AMPK活性，進而下調(diào)p67phox、減少NADPH氧化酶活性。見圖2。

圖1 短暫高糖對HK-2細(xì)胞ROS水平的影響及益氣活血養(yǎng)陰湯干預(yù)作用

圖2 益氣活血養(yǎng)陰湯對短暫高糖刺激后Sirt1、p67phox蛋白表達及AMPK-α2磷酸化程度的影響

3 討論

研究表明，表觀遺傳改變是導(dǎo)致代謝記憶效應(yīng)產(chǎn)生的重要原因之一。表觀遺傳相關(guān)酶Sirt1是一種NAD+依賴性組蛋白去乙?；?，可通過激活A(yù)MPK，增強AMPK對NADPH氧化酶的負(fù)調(diào)控，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]。NADPH氧化酶是ROS生成的關(guān)鍵，研究發(fā)現(xiàn)DN患者腎組織中存在NADPH氧化酶的亞基表達水平增加，而降低NADPH氧化酶活性則可緩解氧化應(yīng)激水平，進而緩解高糖引起的細(xì)胞損傷。

本團隊基于糖尿病腎病“氣陰不足、陰虛耗津、煉津成瘀”的病機理論，認(rèn)為在中醫(yī)學(xué)理論中“代謝記憶”效應(yīng)產(chǎn)生的關(guān)鍵與“血瘀”有關(guān)。團隊根據(jù)氣陰不足為本，瘀血阻滯為標(biāo)的病機，提出以益氣養(yǎng)陰活血法治療糖尿病腎病，自擬驗方益氣養(yǎng)陰活血湯，方中生黃芪益氣扶正，葛根解熱生津，女貞子養(yǎng)陰滋腎，丹參涼血活血，制大黃祛瘀通經(jīng)，全方共奏益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之效[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，對短暫高糖刺激的細(xì)胞進以益氣養(yǎng)陰活血湯進行干預(yù)，可使Sirt1表達、AMPK磷酸化升高，NADPH氧化酶活性及ROS水平降低。以上結(jié)果可表明，短暫高糖可能通過HK-2細(xì)胞內(nèi)Sirt1/AMPK通路引發(fā)持續(xù)性氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致腎損傷“代謝記憶”效應(yīng)，益氣養(yǎng)陰活血湯可能通過Sirt1/AMPK通路的調(diào)控，改善短暫高糖經(jīng)Sirt1對AMPK活性的持續(xù)性抑制，從而降低NADPH氧化酶活性與ROS水平，減輕氧化應(yīng)激，緩解“代謝記憶”效應(yīng)所引起的腎損傷。