降鈣素原(procalcitonin)是反映患者全身炎性反應(yīng)活躍程度的一種蛋白質(zhì)指標［1］，在細菌感染、膿毒癥、臟器功能衰竭等疾病時血漿中的水平與疾病程度呈正比例升高［2］，因可以有效指導(dǎo)臨床抗生素的使用安全而在臨床中廣泛應(yīng)用［3－4］。目前以電化學(xué)發(fā)光－雙抗體夾心法為主流檢測方法，價格較貴，本研究對膠乳增強免疫比濁法與Roche電化學(xué)發(fā)光－雙抗體夾心法檢測降鈣素原結(jié)果進行分析比較，評估檢測成本相對較低的膠乳增強免疫比濁法在臨床使用的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料:采用無菌真空采血管采集住院患者新鮮血液標本2～3 ml，以3 000 r/min分離血清，依照CLSI EP9－A2用患者樣本進行兩種方法比對及偏倚評估，選擇的比對樣本在檢測方法線性范圍內(nèi)呈低、中、高值均勻分布，并且＞50%的標本濃度在正常參考區(qū)間外，兩種檢測方法均使用留取當天的樣本2 h內(nèi)測定完畢。

1.2 儀器與試劑:兩種方法檢測均在Roche Cobas8000全自動生化免疫分析流水線上進行檢測，參比方法使用Roche原裝進口的配套試劑及校準品，采用的檢測方法為電化學(xué)發(fā)光－雙抗體夾心法，檢測范圍是0.02～100 ng/ml，試驗方法試劑為寧波美康生物科技有限公司的降鈣素原檢測試劑盒，檢測方法為膠乳增強免疫比濁法，線性范圍是0.05～60 ng/ml。

1.3 方法

1.3.1 方法的選擇:乳膠增強免疫比濁法為試驗方法(Y)，電化學(xué)發(fā)光－雙抗體夾心法為比較方法(X)，依據(jù)EP9－A2文件要求進行方法間比對實驗。

1.3.2 樣本檢測:操作者能夠熟練掌握使用儀器設(shè)備，實驗前認真做好儀器的保養(yǎng)、校準、維護等。做好室內(nèi)質(zhì)控并保證質(zhì)控結(jié)果受控，然后進行標本的測定，比對方法與實驗方法每個樣本均重復(fù)進行2次檢測。80例患者樣本共得到320個血清樣本測定數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.3.3 數(shù)據(jù)結(jié)果離群值檢查:以檢測結(jié)果絕對差值和相對差值應(yīng)小于4倍平均絕對差值和4倍相對差值平均值作為方法內(nèi)離群點界限;以兩種方法的絕對差值與相對差值，小于4倍的絕對差值平均值和4倍的相對差值平均值作為方法間離群點判斷界限。

1.3.4 數(shù)據(jù)作圖

1.3.4.1 重復(fù)檢測均值的散點圖:以試驗法雙份測定的均值對比較方法雙份測定的均值的散點圖，Y軸為試驗方法即膠乳增強免疫比濁法檢測的結(jié)果，X軸為比較方法(電化學(xué)發(fā)光－雙抗體夾心法)的結(jié)果。

1.3.4.2 所有結(jié)果的散點圖:以試驗方法的每個檢測結(jié)果Yij對比較方法結(jié)果均值作圖。

1.3.4.3 均值差異偏倚圖:以電化學(xué)發(fā)光法為X軸變量(－X)對(Y+X)/2作圖。

1.3.4.4 單個結(jié)果差值偏倚圖:(單個試驗方法結(jié)果YIJ－單個比較方法結(jié)果Xi)對(試驗方法均值比較方法均值2作圖。

1.3.5 X取值范圍合適寬度檢驗:用兩種方法的直線相關(guān)系數(shù)(r)判斷X的取值范圍是否合適夠?qū)?，如果r≥0.975，則可用線性回歸來統(tǒng)計斜率和截距［5］，并計算試驗方法線性回歸方程Y=bX+a。

1.3.6 兩種方法偏倚評價:選定PCT醫(yī)學(xué)決定水平(Xc)的3個濃度水平0.5 ng/ml、2 ng/ml、10 ng/ml計算出相應(yīng)的 Bc%和95%可信區(qū)間，按照美國CLIA'88允許誤差10%為標準，判斷兩種方法偏倚是否可接受。

1.3.7 在PCT醫(yī)學(xué)決定水平0.5 ng/ml、2 ng/ml、10 ng/ml處以比較方法為參考方法計算兩種方法檢測結(jié)果的陽性符合率，評估兩種方法臨床測定結(jié)果的一致性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS22統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)數(shù)據(jù)的比較采用χ2檢驗法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。試驗方法(Y)和比較方法(X)測定數(shù)據(jù)在Excel 2007軟件上按照NCCLS EP9－A2文件要求編制相關(guān)函數(shù)公式進行計算分析，軟件自動進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計并繪制圖表。

2 結(jié)果

(4E)

2.2 數(shù)據(jù)作圖:散點圖1和散點圖2可見，試驗方法與比較方法檢測結(jié)果線性關(guān)系良好，無明顯離群點，數(shù)據(jù)分布均勻;在偏倚圖3、4中可見，兩種方法對同一份標本測定結(jié)果偏差較小，無明顯離群值，分布合理。

圖2 所有結(jié)果的散點圖

圖3 均值差異與二種方法的均值的偏倚圖

圖4 單個結(jié)果差值對兩種方法的均值的偏倚圖

2.3 研究數(shù)據(jù)取值合適范圍的檢驗:比較方法的(X)的取值合適范圍，可用相關(guān)系數(shù)γ做粗略的估計。依據(jù)EP9－A2文件給出的r計算公式得出本研究的r=0.990 92。大于文件要求的r≥0.975的要求，說明本研究數(shù)據(jù)取值范圍合適，回歸方程的斜率和截距可靠。

2.4 直線回歸分析:依據(jù)EP9－A2文件相關(guān)計算公式，本研究數(shù)據(jù)求得截距(a)=0.037斜率(b)=0.99215，直線回歸方程為Y=0.037+0.992 15X。

2.5 臨床可接受評價:相對偏差Bc%=(Bc/Xc)×100%小于1/2CLIA'88相對允許總誤差(TEa%)表明試驗方法的檢測結(jié)果與比較方法一致，具有可比性。見表1。

2.6 選定 PCT醫(yī)學(xué)決定水平0.5 ng/ml、2 ng/ml、10 ng/ml以比較方法為參考方法計算兩種方法檢測值的陽性符合率為95%、96.25%、95.0%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，見表2。

表1 醫(yī)學(xué)決定水平(Xc)偏倚

表2 兩種方法結(jié)果陽性符合率分析

3 討論

目前降鈣素原已在臨床上廣泛的應(yīng)用［6－7］，該項目的檢測方法有凝膠層析法、高效液相色譜分析法、化學(xué)發(fā)光法、放射免疫分析法、膠乳增強免疫比濁法等。而高效液相色譜分析法與凝膠層析法檢測過程費時且不易自動化，難以在醫(yī)院臨床處理大量常規(guī)標本的檢測，放射免疫分析法(RIA)對pH、離子強度、反應(yīng)溫度等要求較高，影響因素很多，雖然在操作過程中注意相關(guān)事項，該方法的檢測結(jié)果的穩(wěn)定性較好，但是不可回避的是它存在著放射污染問題，且試劑有效期短，影響了其發(fā)展。國內(nèi)外應(yīng)用廣泛的PCT檢測分析方法是化學(xué)發(fā)光法，該方法具有高靈敏度，檢測下限≤0.02 ng/ml，有較寬的測定范圍0.02～100 ng/ml，檢測過程不需要任何額外輔助光源，免除了因輔助光源本身穩(wěn)定性、光柵、光波選擇器等的影響，使檢測結(jié)果靈敏度高、穩(wěn)定可靠、誤差較小，同時試劑穩(wěn)定期長。但是電化學(xué)發(fā)光不可避免的問題是試劑成本高，配套的儀器設(shè)備維護費用較高。膠乳增強免疫比濁法操作也是目前較常見的降鈣素原的檢測使用方法，該方法隨著乳膠顆粒技術(shù)上的優(yōu)化和發(fā)展，特別是納米級粒子的推出解決了單克隆抗體結(jié)合力不強的問題，使該方法的檢測線性范圍窄、干擾因素多、實驗室穩(wěn)定差等問題有了顯著的改進。本研究中該試驗方法的檢測線性范圍是0.05～60 ng/ml，成本較電化學(xué)發(fā)光－雙抗體夾心法試劑大幅降低，但由于在抗原抗體特異性反應(yīng)時，生成結(jié)合物的量與反應(yīng)物的濃度有關(guān)，該方法不可避免地會存在該現(xiàn)象。

不同檢測系統(tǒng)結(jié)果不一致的情況是一個普遍存在的問題，也常見很多報道。引起的原因很多，常見的原因除了方法學(xué)不一致，還因血清中可能含有對不同的嗜異體等物質(zhì)，引起某些免疫交叉反應(yīng)［8］。此外還有檢測系統(tǒng)校準品的溯源性不一致，操作者本身在檢測過程中未做好校準、質(zhì)控、試劑穩(wěn)定期、規(guī)范操作等［9］。本研究依據(jù)目前國內(nèi)外實驗室廣泛應(yīng)用的NCCLS EP9－A2文件［10］要求對血清PCT檢測項目在線性范圍內(nèi)，采用國產(chǎn)的膠乳增強免疫比濁法與電化學(xué)發(fā)光免疫分析法進行比較。結(jié)果顯示兩種方法比對數(shù)據(jù)在方法內(nèi)重復(fù)性、方法間的測定結(jié)果均無離散點，數(shù)據(jù)分布均勻［11－12］。兩種檢測方法的相關(guān)系數(shù)r=0.990 92，符合大于文件要求的r≥0.975的要求，直線回歸方程為Y=0.037+0.992 15X，說明本研究數(shù)據(jù)取值范圍合適［13］，回歸方程的斜率和截距可靠，且兩種方法在醫(yī)學(xué)決定水平2 ng/ml、10 ng/ml處的偏倚Bc%＜1/2 CLIA'88允許誤差10%的標準。在醫(yī)學(xué)決定水平0.5 ng/ml的偏倚Bc%相對較大，主要原因是膠乳增強免疫比濁法的線性范圍0.05～60 ng/ml，相對比較方法電化學(xué)發(fā)光法的最低檢出限0.02 ng/ml，靈敏度低于比較方法，導(dǎo)致樣本中PCT含量較低的時候，報告數(shù)據(jù)產(chǎn)生的差異相對值大，但是對于兩個系統(tǒng)在0.5 ng/ml醫(yī)學(xué)決定水平的臨床陰陽結(jié)果判斷差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，對細菌感染的診斷并無影響，所以表明兩種方法偏倚可以接受。以電化學(xué)發(fā)光作為比較方法，兩種方法的陽性符合率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

同時要注意的是本研究的試驗方法其產(chǎn)品說明書上標注的試劑開瓶穩(wěn)定期可達30 d，但該方法檢測線性范圍是0.05～60 ng/ml，臨床參考限一般設(shè)定＜0.5 ng/ml，由于臨床參考線與該方法最低檢測限相對較接近且含量較低，所以在使用過程中要嚴格保證校準品的質(zhì)量及校準頻次。本研究過程中每次檢測前均進行了校準與質(zhì)控，對比每次定標與不同批次校準品定標后的結(jié)果偏差，同時要認真比較每次校準的曲線空白值與吸光系數(shù)，如果多點定標中校準液低值接近或低于參考線值時需要稀釋校準品中的低值校準液，或者聯(lián)系廠家提供低值校準液。某些時候校準品由于批次、運輸或存儲過程等多方面的影響導(dǎo)致校準品偏倚較大［14－15］。并且兩者廠家均說明了各自方法對血清抗干擾的能力如在溶血、黃疸、脂血等方面的程度要求，但是兩種方法的抗干擾能力不同，為避免偏差，本研究統(tǒng)一選擇兩種方法都均不受影響的血清樣本進行比對。綜上所述，在對檢測結(jié)果準確和快速高效的前提下，相對較低的成本、簡便的操作成為檢驗用戶及患者的目標［8］。本研究中的膠乳增強免疫比濁法與電化學(xué)發(fā)光法，在規(guī)范的質(zhì)量體系和標準的操作程序下均能有效檢測降鈣素原且相關(guān)性良好，均能滿足臨床需要，適合臨床實驗室推廣使用。