何依雪 劉文 沈祥陵

（三峽區(qū)域植物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室（三峽大學(xué)）湖北省三峽特色植物繁育工程技術(shù)研究中心 三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心，宜昌 443000）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是全球第四大糧食作物，糧菜兼用，具有營養(yǎng)豐富、生長季節(jié)短、儲運(yùn)方便等特點［1-3］。馬鈴薯以無性繁殖為主，在繁殖中病毒積累會導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降，但隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，利用組織培養(yǎng)脫毒試管薯技術(shù)從根本上解決了馬鈴薯的品種退化問題［4-5］。在馬鈴薯試管薯誘導(dǎo)研究中已發(fā)現(xiàn)光周期［6］、大量元素組合［7］、多種激素［8］、蔗糖濃度［9］和培養(yǎng)基類型［10］都對馬鈴薯試管薯的形成有影響。馬鈴薯塊莖的形成是匍匐莖的生長及其頂端的膨大，以及塊莖內(nèi)淀粉的合成和貯藏蛋白的積累的結(jié)果，所以培養(yǎng)基內(nèi)的糖類物質(zhì)和激素水平成為研究試管薯形成的重要原因。

蔗糖是植物葉片光合作用的主要產(chǎn)物，在成熟葉片合成以后除了供應(yīng)自身代謝以外還運(yùn)輸?shù)街参锏母鞣N異養(yǎng)組織利用與貯藏［11］。蔗糖除了為植物生長過程中提供必要的能源物質(zhì)外，同時也是參與植物生長發(fā)育的一種重要的信號分子，例如參與調(diào)節(jié)植物的細(xì)胞周期、基因表達(dá)［12-13］。蔗糖對馬鈴薯塊莖形成的影響之前已經(jīng)有了一些研究成果。將馬鈴薯種植在大棚中裝有河沙的桶內(nèi)，分別用0、4%、8%蔗糖澆灌，發(fā)現(xiàn)8%蔗糖澆灌條件下馬鈴薯植株的結(jié)薯數(shù)量以及塊莖干物質(zhì)量明顯高于0%蔗糖的處理和4%蔗糖處理［14］；霍鳳玲等［15］在馬鈴薯試管苗的培養(yǎng)基中添加高濃度的蔗糖誘導(dǎo)會使馬鈴薯結(jié)薯增多。由此表明高濃度外源蔗糖對馬鈴薯田間培養(yǎng)和試管培養(yǎng)均具有促進(jìn)塊莖形成的作用。

早在20世紀(jì)50年代，就有人對外源添加GA對馬鈴薯生長和塊莖形成的影響進(jìn)行了研究。幾乎所有報道都一致認(rèn)為，GA促進(jìn)了馬鈴薯整株或離體莖、葉和匍匐莖的生長，但抑制或延緩了塊莖的形成［16］，認(rèn)為光周期與溫度對結(jié)薯的影響其實是對馬鈴薯內(nèi)源GA水平的調(diào)控的結(jié)果［17-18］，并且其他激素對于馬鈴薯塊莖形成的影響也是由于改變了GA的水平造成的［9］。本實驗選取蔗糖濃度，GA濃度和培養(yǎng)基類型三種因素進(jìn)行正交試驗，研究馬鈴薯試管薯結(jié)薯的最優(yōu)培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：馬鈴薯“Desiree”。試劑：MS粉末（Phyto Technology），蔗糖（科密歐），瓊脂（Solarbio），赤霉素（北京振泰），葡萄糖（科密歐），果糖（阿拉?。?。

基本MS培養(yǎng)基配方：MS粉末：4.43 g/L，蔗糖：30 g/L，瓊脂：10 g/L。

1.2 方法

1.2.1 試管苗的培養(yǎng) 用MS+3%蔗糖+1%瓊脂（MS3）的培養(yǎng)基培養(yǎng)馬鈴薯莖段，將脫毒馬鈴薯苗剪段插瓶培養(yǎng)至馬鈴薯苗生長良好，一株可繼代出5-6株，為后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。

1.2.2 不同糖類對馬鈴薯組培的影響 基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，分別添加3%的葡萄糖、果糖和蔗糖。將馬鈴薯剪成5 cm長的莖段，每種培養(yǎng)基接種15株馬鈴薯。45 d后統(tǒng)計馬鈴薯的結(jié)薯個數(shù)和薯重。

1.2.3 蔗糖、GA與培養(yǎng)基種類對馬鈴薯的影響 基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，利用蔗糖濃度，GA濃度，培養(yǎng)基類型3種因素制作正交實驗表格如表1。將馬鈴薯剪成5 cm長的莖段，每種培養(yǎng)基接種30株馬鈴薯。在第35天、60天和95天分別統(tǒng)計馬鈴薯的結(jié)薯個數(shù)和95 d的單薯重。

表1 正交實驗設(shè)計

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用SPPS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用GraphPad Prism 6作圖。

2 結(jié)果

2.1 糖的種類對馬鈴薯結(jié)薯的影響

培養(yǎng)基中添加3種不同的碳源、葡萄糖、果糖和蔗糖，45 d后統(tǒng)計結(jié)薯數(shù)量，蔗糖結(jié)薯量最高，達(dá)到0.46個/株，葡萄糖最低，只有0.2個/株（圖1-A）。稱量收獲的馬鈴薯重量，均重最大的是添加葡萄糖的培養(yǎng)基，達(dá)到89 mg（圖1-B），但3組數(shù)據(jù)沒有顯著性差異。

2.2 蔗糖、GA和培養(yǎng)基種類對馬鈴薯結(jié)薯的影響

2.2.1 對馬鈴薯植株的影響 在培養(yǎng)基中添加不同濃度的蔗糖和GA會使馬鈴薯的外形受到影響，隨著蔗糖濃度的升高，馬鈴薯植株的株高逐漸變矮（圖2-A）。培養(yǎng)基類型對馬鈴薯培養(yǎng)基中的匍匐莖有影響，在液體培養(yǎng)基中馬鈴薯的匍匐莖較粗大，呈膨大狀態(tài)，但很少形成成熟的馬鈴薯（圖2-B）。

圖1 不同糖的種類對馬鈴薯結(jié)薯的影響

2.2.2 對馬鈴薯結(jié)薯時間的影響 如圖3-A，在35 d、60 d、95 d分別統(tǒng)計結(jié)薯量，發(fā)現(xiàn)最早結(jié)薯的是14號8%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養(yǎng)基，在35 d時結(jié)一顆馬鈴薯。

在60 d時添加8%蔗糖的4組培養(yǎng)基都有不同程度的結(jié)薯，最多的還是14號結(jié)薯0.53個/株；添加5%蔗糖的培養(yǎng)基只有10號5%蔗糖+0.1 mg/L GA+固體培養(yǎng)基結(jié)薯0.2個/株；添加3%和1%蔗糖的所有培養(yǎng)基均未有成熟的馬鈴薯。

第95天時，添加3%、5%和8%蔗糖的培養(yǎng)基均有不同程度的結(jié)薯，但添加1%蔗糖的4組培養(yǎng)基均未結(jié)薯，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)有限，植物無法繼續(xù)生長，故停止統(tǒng)計。

2.2.3 對馬鈴薯結(jié)薯個數(shù)的影響 在第95天時統(tǒng)計各組培養(yǎng)基馬鈴薯結(jié)薯的情況，無論GA濃度如何，添加1%蔗糖的培養(yǎng)基均未結(jié)薯。其他組都有結(jié)薯，其中結(jié)薯最多的是6號3%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養(yǎng)基，平均1.5個/株。11號5%蔗糖+0.5 mg/L GA+固體培養(yǎng)基，14號8%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養(yǎng)基，16號8%蔗糖+1.0 mg/L GA+固體培養(yǎng)基都達(dá)到1個/株以上（圖3-B）。

圖2 同培養(yǎng)基中馬鈴薯的不同部位的外形比較

2.2.4 對馬鈴薯薯重的影響 對馬鈴薯的單薯重和均重進(jìn)行統(tǒng)計，如圖3-C，均重最大的是6號3%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養(yǎng)基以及9號5%蔗糖+0 mg/L GA+液體培養(yǎng)基，分別是341 mg和342 mg；其次是14號8%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養(yǎng)基和15號8%蔗糖+0.5 mg/L GA+液體培養(yǎng)基，分別重258 mg和226 mg；其他均在120 mg以下。

馬鈴薯薯重的數(shù)據(jù)比較集中和薯重的均數(shù)的趨勢基本符合（圖3-E），6號3%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養(yǎng)基，9號5%蔗糖+0 mg/L GA+液體培養(yǎng)基，14號8%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養(yǎng)基和15號8%蔗糖+0.5 mg/L GA+液體培養(yǎng)基薯重均重大，數(shù)據(jù)均勻。

統(tǒng)計每組的大薯率（重量大于100 mg），大薯率在60%以上的有：6號3%蔗糖+0.1 mg/L GA+液體培養(yǎng)基；9號5%蔗糖+0 mg/L GA+液體培養(yǎng)基；12號5%+1.0 mg/L GA+液體培養(yǎng)基；和15號8%蔗糖+0.5 mg/L GA+液體培養(yǎng)基。5號3%蔗糖+0 mg/L GA+固體培養(yǎng)基和13號8%蔗糖+0 mg/L GA+固體培養(yǎng)基沒有薯重大于100 mg的馬鈴薯。當(dāng)蔗糖的含量相同時，無論施加GA的含量，液體培養(yǎng)基的薯重都大于固體培養(yǎng)基的薯重（圖3-D）。

圖3 不同培養(yǎng)基對馬鈴薯結(jié)薯的影響

3 討論

馬鈴薯塊莖形成的過程是一個十分復(fù)雜的過程，據(jù)研究有幾種可能的調(diào)控途徑都會影響馬鈴薯的結(jié)薯過程［6-10］，蔗糖的調(diào)控途徑與GA調(diào)控途徑的關(guān)系也有很多人在探索，Xu［9］和郭春華等［19］認(rèn)為蔗糖通過影響GA水平來影響馬鈴薯塊莖的形成，郭春華等人提出在試管薯誘導(dǎo)的過程中必須添加高濃度的蔗糖，因為蔗糖會降低赤霉素活性從而促進(jìn)結(jié)薯，而這種赤霉素活性的降低是通過蔗糖與赤霉素結(jié)合形成配糖體來實現(xiàn)的。而Ou等［20］發(fā)現(xiàn)GA可以影響馬鈴薯液泡酸性轉(zhuǎn)化酶（vacuolar acid invertase，vacINV）基因啟動子活性，并推測GA可以促進(jìn)vacINV的表達(dá)，促進(jìn)蔗糖分解從而達(dá)到抑制結(jié)薯的目的。García等［21］認(rèn)為蔗糖可能通過調(diào)

控ABA應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（AREB/ABF）類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)而參與ABA-GA信號交聯(lián)途徑促進(jìn)結(jié)薯。Chincinska等［22］則認(rèn)為光周期和GA會影響蔗糖運(yùn)輸?shù)鞍譻tSUT4的表達(dá)，從而影響可能的下游基因stCOL3和stFT的表達(dá)和蔗糖的運(yùn)輸來影響塊莖的形成。由此可見，馬鈴薯塊莖的調(diào)控過程是各種調(diào)控途徑相互關(guān)聯(lián)的結(jié)果。

表2 正交實驗的極差分析

本實驗通過蔗糖、GA以及培養(yǎng)基類型的三因素的正交試驗選出馬鈴薯試管薯結(jié)薯的最優(yōu)培養(yǎng)基。對實驗結(jié)果進(jìn)行極差分析（表2），3個因素對馬鈴薯結(jié)薯數(shù)的影響程度大小分別是蔗糖濃度＞GA濃度＞培養(yǎng)基種類，其中培養(yǎng)基種類對馬鈴薯的結(jié)薯數(shù)幾乎無影響。液體培養(yǎng)基中馬鈴薯在培養(yǎng)基中的匍匐莖呈現(xiàn)膨大狀態(tài)（圖1-B），但沒有發(fā)育成完整的成熟馬鈴薯。這可能是由于培養(yǎng)瓶空間和培養(yǎng)基營養(yǎng)有限造成的，所以結(jié)薯期晚的液體培養(yǎng)基中大多形成膨大的匍匐莖，而未形成馬鈴薯。

對馬鈴薯薯重的影響程度大小分別是培養(yǎng)基種類＞GA濃度＞蔗糖濃度，由于添加1%的蔗糖的培養(yǎng)基未結(jié)薯，所以在計算極差時不考慮在內(nèi)。在圖2-C中，可以明顯的看到液體培養(yǎng)基6號、9號和14號形成的馬鈴薯大于固體培養(yǎng)基5號、10號和13號形成的馬鈴薯。

對馬鈴薯的大薯率的影響程度大小分別是培養(yǎng)基種類＞GA濃度＞蔗糖濃度，但GA濃度和蔗糖濃度對大薯率的影響幾乎無差別。從圖3-D中可以看到，液體培養(yǎng)基的大薯率明顯高于固體培養(yǎng)基。由于在晚結(jié)薯的液體培養(yǎng)基中，如7號培養(yǎng)基匍匐莖膨大很明顯但未能形成成熟的馬鈴薯（圖2-B），所以未能得到數(shù)量多的馬鈴薯，但是如果給與更多的營養(yǎng)與空間是有可能產(chǎn)生更多的馬鈴薯。

通過對實驗結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)蔗糖、GA和培養(yǎng)基種類都能影響馬鈴薯的塊莖形成過程。高濃度的蔗糖能夠促使馬鈴薯結(jié)薯，這與胡云海［23］，霍鳳蘭等［15］的研究結(jié)果一致，但本實驗發(fā)現(xiàn)高濃度蔗糖只是縮短了馬鈴薯結(jié)薯的時間，并不能增加結(jié)薯的總量。液體培養(yǎng)基能夠顯著地提升馬鈴薯的薯重，增大馬鈴薯的大薯率，這與霍鳳蘭［15］，劉玲玲等［24］的結(jié)果相同。GA對馬鈴薯結(jié)薯的抑制［25］過程也不是絕對的，在蔗糖濃度相同時，在液體培養(yǎng)基中施加低濃度的GA比固體培養(yǎng)基中不添加GA的馬鈴薯結(jié)薯多，這可能是由于GA能夠增加馬鈴薯匍匐莖數(shù)目，促使匍匐莖伸長，而馬鈴薯塊莖是匍匐莖膨大形成的；液體培養(yǎng)基可能促進(jìn)了匍匐莖的膨大，所以液體培養(yǎng)基中的匍匐莖數(shù)量多，發(fā)生膨大，也可以解釋收獲的馬鈴薯大多呈長條狀，所以GA與液體培養(yǎng)基的組合對馬鈴薯塊莖的形成十分有利。但蔗糖和GA在馬鈴薯塊莖形成的具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證明。

通過本實驗的研究得到了使試管薯結(jié)薯增多薯重增大的培養(yǎng)基，加快了試管薯的繁育速度，增加了試管薯的體積，解決了利用塊莖作為外植體的馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化的外植體獲得時間長的問題，對馬鈴薯種薯的繁育也有一定的積極意義。

4 結(jié)論

本實驗通過設(shè)計蔗糖濃度、GA濃度及培養(yǎng)基類型的正交實驗，對馬鈴薯的結(jié)薯時間、結(jié)薯數(shù)量、薯重和大薯率進(jìn)行統(tǒng)計，得到添加8%蔗糖和0.1 mg/L GA的液體MS培養(yǎng)基能夠使馬鈴薯提前結(jié)薯并且得到的馬鈴薯數(shù)量多，薯重大。