陳蔚燕

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院, 山東 青島 266109)

五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinen-sis( Turcz. ) Baill. 的干燥成熟果實(shí), 其性酸、甘、溫[1-3], 具有益氣、斂肺、生津、止渴、止瀉、斂汗、壯陽(yáng)、補(bǔ)腎等功能[4-5]，關(guān)于五味子在對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥方面的藥理研究比較多[6-8]。五味子具有殺菌抑菌的作用，但研究主要集中在其對(duì)醫(yī)學(xué)細(xì)菌的抑制活性方面[9-12]，關(guān)于其對(duì)農(nóng)作物病原真菌的活性研究較少。目前農(nóng)業(yè)上對(duì)植物病害的防治仍主要依靠化學(xué)殺菌劑，為了開(kāi)發(fā)植物源農(nóng)藥，本文以五味子為試材，對(duì)其提取物進(jìn)行抑菌活性研究，為五味子作為殺菌劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 試劑與材料 五味子(青島市同方大藥房)，瓊脂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司), 葡萄糖(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)，無(wú)水乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，丙酮(萊陽(yáng)市康德化工有限公司)，乙酸乙酯(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；柑橘炭疽病菌、棉花枯萎病菌、小麥全蝕病菌、白菜灰斑病菌、辣椒炭疽病菌等植物病原真菌的菌種均由山東省農(nóng)業(yè)仿生應(yīng)用工程技術(shù)研究中心提供，菌種使用前均進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)。

1. 2 儀器與設(shè)備 FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)，LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)，250D恒溫光照培養(yǎng)箱(常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司)，SW--CG--2FD型凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，WD900B型微波爐(順德市格蘭仕微波電器有限公司)，101C-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)，RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，SHZ-D循環(huán)水式真空泵(河南鞏義市英峪豫華儀器廠)，電子分析天平(美特勒-托利多儀器上海有限公司)，XH-100A型微波催化合成/萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)。

1.3方法

1.3.1 五味子索式提取法提取物的制備方法 將五味子烘干至恒重，粉碎，稱(chēng)取粉碎的五味子樣品適量于250 mL 三頸燒瓶中, 加入適量的丙酮，置于索氏提取器上浸提。過(guò)濾得到上清液，合并上清液，得到五味子提取液，提取液經(jīng)旋蒸濃縮干燥，得提取物，置于4℃冰箱保存，備用。

1.3.2 五味子微波正交提取法提取物的制備方法 稱(chēng)取粉碎的樣品適量, 置于250 mL 三頸燒瓶中, 加入適量的萃取溶劑，并置于微波腔中, 裝上冷凝管, 在MDS-8G型微波萃取系統(tǒng)中, 用相應(yīng)的功率于適當(dāng)?shù)妮腿r(shí)間和適當(dāng)?shù)妮腿囟认逻M(jìn)行微波萃取。萃取完成后，稍冷，旋蒸濃縮。按照如下設(shè)計(jì)的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，正交因素水平(表1)。

表1 正交因素水平表

1.3.3 菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)抑菌效果的測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定五味子提取物的抑菌活性。將提取物用移液槍移取一定的母液加入100 mL 培養(yǎng)基內(nèi)配成相應(yīng)濃度，每組實(shí)驗(yàn)均作對(duì)照。在超凈工作臺(tái)上把培養(yǎng)基倒入直徑為 6 cm 或 7.5 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)制成含藥平板備用，用接種針把打好孔的活化菌絲塊接到制備好的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)處理重復(fù)3次，薄膜包好，放入恒溫 27 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 3 d 左右。待對(duì)照組 (CK) 里的菌餅長(zhǎng)到培養(yǎng)皿 2/3 左右時(shí)，用十字交叉法測(cè)量各個(gè)菌落直徑，計(jì)算各提取物的抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 索式提取法五味子丙酮提取物抑菌效果 五味子丙酮提取物抑菌數(shù)據(jù)(表2)，從對(duì)各個(gè)病菌的抑菌率可以看出，隨著五味子濃度的增大，抑菌率增大。其中對(duì)白菜灰斑病菌的抑制效果最好，在8.00 mg/mL時(shí)的抑菌活性達(dá)到88.64%。

表2 五味子丙酮提取物對(duì)5種不同病原菌的抑菌率(%)

2.2 不同提取條件對(duì)五味子提取物抑菌活性的影響 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案選用3水平4因素正交設(shè)計(jì)，五味子的乙醇、丙酮、乙酸乙酯微波提取液采取4.00 g/L濃度，測(cè)定其對(duì)棉花枯萎病菌的抑菌活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表3)。

表3 五味子微波提取物在4.00 g/L下對(duì)棉花枯萎病菌抑制活性正交設(shè)計(jì)表

注：試驗(yàn)號(hào)1-9指的是做了9次不同因素的實(shí)驗(yàn)

從表3可以看出五味子丙酮提取液在4.00 g/L濃度下對(duì)棉花枯萎病菌均有一定的抑菌作用。五味子丙酮提取液最高抑菌率約達(dá)69.9%。通過(guò)極差R分析，可以看出五味子提取物對(duì)真菌抑制最佳方案為：溶劑丙酮，功率400 W，樣品與溶劑比5:70，反應(yīng)時(shí)間5 min。

2.3 五味子微波提取物對(duì)小麥全蝕病菌的抑菌活性 取五味子的微波提取物加入滅菌的PDA培養(yǎng)基中，配制含藥濃度梯度分別為1、2、3、4、5、6、7、8、10 mg/mL的含藥平板，采用上述的菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌活性，并求出對(duì)各菌種的EC50。五味子提取物對(duì)小麥全蝕病菌的抑菌作用(圖1)。

圖1 五味子對(duì)小麥全蝕病菌的抑菌數(shù)據(jù)圖

從圖1結(jié)果可以看出，五味子丙酮提取物對(duì)小麥全蝕病菌的抑制效果是隨著濃度的增加而增加，五味子丙酮提取物對(duì)小麥全蝕病菌的有效抑制中濃度EC50為2.83 mg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.970 8。

3 總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采用浸提法和正交試驗(yàn)微波方式對(duì)五味子進(jìn)行了提取，并對(duì)其提取液進(jìn)行了抑制病原真菌活性的實(shí)驗(yàn)，供試菌種為柑橘炭疽、小麥全蝕和棉花枯萎等幾種真菌，從實(shí)驗(yàn)中測(cè)得索式提取法丙酮提取五味子提取液的抑菌活性，通過(guò)抑菌數(shù)據(jù)可知，在浸提法中五味子對(duì)5種植物病原真菌都有抑制作用，且隨著五味子濃度的增大抑菌率增大。在微波提取中以萃取功率400 W，萃取時(shí)間5 min，樣品與溶劑比5:70，溶劑為丙酮時(shí)為最佳提取工藝，同時(shí)求出了五味子提取液對(duì)小麥全蝕病原真菌的有效抑制中濃度。五味子的微波提取物對(duì)幾種真菌具有抑菌效果，本實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)[13]中所描述的石菖蒲的微波抑菌效果相比，具有更高的抑菌率。本研究為五味子今后應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和開(kāi)發(fā)植物源農(nóng)藥殺菌劑提供了一定的指導(dǎo)意義。