楊 帆 肖華西 林親錄 張 倩 王素艷 羅非君 葉 雅

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 長沙 410004)

抗性淀粉(resistant starch，RS)是指不被健康人體小腸吸收的淀粉及其分解物的總稱[1]，具有良好生理功能，可抑制餐后血糖快速升高，減少血清中膽固醇和甘油三酸酯的量，并能有效促進腸道中有益菌的生長和繁殖[2-5]。盡管RS的種類很多，但RS1和RS2由于性質(zhì)不穩(wěn)定會在加工過程中造成大量損失，而RS3卻是淀粉經(jīng)糊化后由于老化(回生)作用而形成的一類特殊的淀粉結(jié)構(gòu)[6]，因此RS3有較高的開發(fā)利用價值，并引起了人們的普遍關(guān)注。目前，大米RS3型抗性淀粉制備方法主要有酸變性和水熱處理[7]、酶法處理[8]和壓熱處理[9]等，這些單一處理使大米淀粉整體降解性差，RS3得率普遍偏低。本研究采用超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備大米RS3型抗性淀粉，通過優(yōu)化實驗選出最佳工藝條件，為RS3的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 原料

東北粳米淀粉：無錫市天之源食品有限公司，抗性淀粉約占0.67%。

1.2 試劑

無水乙醇(分析純)：天津市富于精細化工有限公司；氫氧化鈉、氫氧化鉀(均為分析純)：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；檸檬酸(食品級)：濰坊英軒實業(yè)有限公司；氯化鉀(分析純)、順丁烯二酸(化學(xué)純)、二水氯化鈣(分析純)：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸(分析純)：湖南匯虹試劑有限公司；抗性淀粉檢測試劑盒：上海超研生物科技有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

101C-2AB電熱恒溫鼓風干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；400T多功能粉碎機：鉑歐五金廠；DZKW-4恒溫振蕩器：常州澳華儀器有限公司；FS-250超聲波處理器：上海生析超聲儀器有限公司；L530臺式低速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；722 s可見光分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Super4 RVA快速黏度分析儀：澳大利亞Newport Scientific儀器公司；Multizoom AZ100/AZ100M多功能顯微鏡：尼康儀器(上海)有限公司；濕熱反應(yīng)罐：實驗室自制。

1.4 方法

1.4.1 超聲波-濕熱法制備RS3

1.4.1.1 制備工藝

稱取一定量的大米淀粉，加入適量蒸餾水，配成不同濃度的淀粉懸浮液，將該大米淀粉懸浮液在沸水浴中攪拌糊化60 min，在40 ℃下，用超聲波發(fā)生器產(chǎn)生的100 W的超聲波處理30 min，放入自制濕熱反應(yīng)罐中密閉平衡24 h，調(diào)節(jié)烘箱溫度，烘烤一定時間，取出冷卻至室溫后于 4 ℃冷藏 24 h，烘干，研磨過100目篩。

1.4.1.2 單因素實驗設(shè)計

選擇影響RS3得率的3個主要因素:含水量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間。

1)含水量對RS3得率的影響。稱取20 g大米淀粉，加入適量蒸餾水，使其含水量分別為20%、25%、30%、35%、40%，將大米淀粉懸浮液在沸水浴中攪拌糊化60 min，在40 ℃下，用超聲波發(fā)生器產(chǎn)生的100 W的超聲波處理30 min，放入自制濕熱反應(yīng)罐中密閉平衡24 h，移入烘箱中，110 ℃烘烤10 h，取出冷卻至室溫后于 4 ℃冷藏 24 h，烘干，研磨過100目篩, 測定各樣品的RS3含量。

2)反應(yīng)溫度對RS3得率的影響。稱取20 g大米淀粉，加入適量蒸餾水，使其含水量為25%。將該大米淀粉懸浮液在沸水浴中攪拌糊化60 min，在40 ℃下，用超聲波發(fā)生器產(chǎn)生的100 W的超聲波處理30 min，放入自制濕熱反應(yīng)罐中密閉平衡24 h，移入烘箱中，溫度分別設(shè)置為100、110、120、130、140 ℃，烘烤10 h，取出冷卻至室溫后于 4 ℃冷藏24 h，烘干，研磨過100目篩, 測定各樣品的RS3含量。

3)反應(yīng)時間對RS3得率的影響。稱取20 g大米淀粉，加入適量蒸餾水，使其含水量為25%。將該大米淀粉懸浮液在沸水浴中攪拌糊化60 min，在40 ℃下，用超聲波發(fā)生器產(chǎn)生的100 W的超聲波處理30 min，放入自制濕熱反應(yīng)罐中密閉平衡24 h，移入烘箱中，在110 ℃分下別烘烤8、10、12、14、16 h，取出冷卻至室溫后于 4 ℃冷藏 24 h，烘干，研磨過100目篩, 測定各樣品的RS3含量。

1.4.1.3 正交實驗設(shè)計

在單因素實驗基礎(chǔ)上，每個因素各選出3個水平，采用3因素3水平正交實驗 L9(34)，以確定最佳工藝條件。

1.4.2 超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備RS3

1.4.2.1 制備工藝

稱取20 g大米淀粉，加入適量蒸餾水，使其含水量為30%。將該大米淀粉懸浮液在沸水浴中攪拌糊化60 min，在40 ℃下，用超聲波發(fā)生器產(chǎn)生的100 W的超聲波處理30 min，放入自制的濕熱反應(yīng)罐中密閉平衡24 h，移入烘箱中烘烤,在130 ℃下烘烤10 h，取出冷卻至室溫后于 4 ℃冷藏 24 h，加入一定濃度檸檬酸混勻，放入100 ℃的水浴鍋中加熱一定時間，冷卻置于4 ℃的冰箱老化一定時間，移入35 ℃的烘箱中烘48 h，研磨過100目篩，用去離子水洗滌5遍，棄去上清液，將沉淀放入35 ℃的烘箱中烘24 h，研磨過100目篩。

1.4.2.2 單因素實驗設(shè)計

在超聲波-濕熱法制備RS3實驗的最佳工藝條件基礎(chǔ)上，綜合考察和分析了各影響因素在酸水解過程中對RS3得率的影響，確定以酸的濃度、加熱時間、老化時間為主要考察因素進行單因素實驗。

1)酸的濃度對RS3得率的影響。樣品經(jīng)最佳超聲波-濕熱法條件處理后，分別加入濃度為0.00、0.05、0.10、0.15、0.20 mol/L的檸檬酸溶液，按淀粉∶酸為2∶3的比例在100 mL燒杯中混合均勻。將混合物放置于100 ℃的恒溫水浴鍋中加熱攪拌20 min，冷卻至室溫后置于4 ℃的冰箱老化36 h，移入35 ℃的烘箱中烘48 h，研磨過100目篩，用去離子水洗滌5遍，棄去上清液，將沉淀放入35 ℃的烘箱中烘24 h，研磨過100目篩, 測定各樣品的RS3含量。

2)加熱時間對RS3得率的影響。樣品經(jīng)最佳超聲波-濕熱法條件處理后，加入濃度為0.15 mol/L的檸檬酸溶液，按淀粉∶酸為2∶3的比例在100 mL燒杯中混合均勻。將混合物放置于100 ℃的恒溫水浴鍋中分別加熱攪拌10、15、20、25、30 min，冷卻至室溫后置于4 ℃的冰箱老化36 h，移入35 ℃的烘箱中烘48 h，研磨過100目篩，用去離子水洗滌5遍，棄去上清液，將沉淀放入35 ℃的烘箱中烘24 h，研磨過100目篩, 測定各樣品的RS3含量。

3)老化時間對RS3得率的影響。樣品經(jīng)最佳超聲波-濕熱法條件處理后，加入濃度為0.15 mol/L的檸檬酸溶液，按淀粉∶酸為2∶3的比例在100 mL燒杯中混合均勻。將混合物放置于100 ℃的恒溫水浴鍋中加熱攪拌20 min，冷卻至室溫后置于4 ℃的冰箱中分別老化12、24、36、48、60 h，移入35 ℃的烘箱中烘48 h，研磨過100目篩，用去離子水洗滌5遍，棄去上清液，將沉淀放入35 ℃的烘箱中烘24 h，研磨過100目篩, 測定各樣品的RS3含量。

1.4.2.3 正交實驗設(shè)計

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，對每一種影響因素篩選3個水平，進行正交實驗，以確定最佳的工藝條件。

1.4.3 RS含量的測定

參照抗性淀粉試劑盒說明書中的方法進行測定[10-11]。

抗性淀粉的質(zhì)量分數(shù)=ΔE×F/W×0.1×0.9×100%

式中：ΔE：空白試劑的吸光度值；F：D-葡萄糖含量除以D-葡萄糖的吸光度值；W：樣品質(zhì)量/g。

1.4.4 大米抗性淀粉的理化性質(zhì)的測定

1.4.4.1 含水量測定[12]

式中：m0：稱量瓶的質(zhì)量/g；m1：稱量瓶和試樣的質(zhì)量/g；m2：稱量瓶和試樣干燥后的質(zhì)量/g。

1.4.4.2 溶解性測定

將淀粉懸浮液在30 ℃的水浴鍋中攪拌30 min，在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，棄去上清液，將沉淀在105 ℃下烘干稱重，即得水溶淀粉的質(zhì)量。

式中：X0：淀粉樣品干質(zhì)量；X1：水溶淀粉質(zhì)量。

1.4.4.3 膨潤力測定

按照1.4.4.2中的方法，所得沉淀為膨脹淀粉，稱其質(zhì)量即為膨脹淀粉的質(zhì)量。

式中：X0：淀粉樣品干質(zhì)量/g；X1：水溶淀粉質(zhì)量/g；X2：膨脹淀粉質(zhì)量/g。

1.4.4.4 糊化性質(zhì)測定

采用RVA快速黏度分析儀測定：樣品含水量在14%時，稱取3 g樣品，加入到裝有25.0 mL蒸餾水的鋁罐中，按此標準根據(jù)樣品水分含量稱取準確的樣品量及蒸餾水。參數(shù)設(shè)置由Thermocline for windows軟件控制。

1.4.4.5 偏光顯微鏡觀察

將少量淀粉懸浮于1 mL去離子水中，吸取一滴淀粉溶液滴在載玻片上，輕輕將蓋玻片蓋上，將氣泡趕出。選擇合適的物鏡及放大倍數(shù)對抗性淀粉和原大米淀粉進行偏光十字和形態(tài)進行觀察。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次，采用 Origin、SPSS statistics軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波-濕熱法制備RS3最佳工藝條件

2.1.1 單因素實驗結(jié)果

如圖1所示，淀粉含水量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間不同，RS3的得率也不同。超聲處理對淀粉產(chǎn)生“空化效應(yīng)”，在高溫高壓下加劇淀粉分子與溶劑分子間的摩擦，使直鏈淀粉、支鏈淀粉溶出，導(dǎo)致淀粉鏈破裂，有利于生成抗性淀粉。后經(jīng)濕熱處理，RS3的得率在含水量為25%時最大，其后隨淀粉含水量增大而減小。這主要是因為當含水量低于25%時，整個體系的黏度很低，直鏈分子之間彼此接觸的概率?。划敽看笥?5%時，淀粉糊的黏度很大，沒有足夠的水分子進入淀粉的結(jié)晶區(qū)，氫鍵破壞不完全，淀粉分子難以充分糊化，阻礙了直鏈淀粉分子相互接近并形成結(jié)晶，不利于RS3的形成[13-14]。濕熱處理的溫度是影響RS3得率的主要因素之一。當溫度為110 ℃時RS3得率達到最大，高于110 ℃之后，RS3得率開始減少。高溫為淀粉分子提供了大量的能量，有利于淀粉分子鏈的遷移，冷卻后淀粉分子形成新的聚合體成為RS3，但隨著溫度升高，過高的溫度導(dǎo)致直鏈淀粉過度降解，產(chǎn)生的淀粉聚合度小，也不利于RS3的形成。隨著濕熱反應(yīng)時間的延長，在10 h時RS3得率達到最大，之后逐漸減少。濕熱處理時間過短，淀粉粒中的直鏈淀粉分子游離不完全；當處理時間超過10 h后，直鏈淀粉分子過度降解成一些分子質(zhì)量小的短直鏈淀粉分子鏈，分子鏈擴散速度快，難以聚集，這都不利于形成RS3[15-16]。

圖1 超聲波-濕熱處理對抗性淀粉含量的影響

2.1.2 正交實驗結(jié)果

正交實驗因素和水平如表1所示，正交實驗結(jié)果見表2。從表2可以看出，各因素的R值均大于空列R值，表明每個因素對RS3得率的影響都是有效的。這3個因素對RS3得率影響的主次順序為：B(反應(yīng)溫度)>A(含水率)>C(反應(yīng)時間)。最優(yōu)組合為A2B3C1，即含水率為30%，處理溫度為130 ℃，處理時間為10 h,RS3的得率最高，為32.173%。

表1 超聲波-濕熱法制備大米抗性淀粉工藝條件正交實驗因素水平

表2 L9(34)正交實驗表

2.2 超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備RS3最佳工藝條件

2.2.1 單因素實驗結(jié)果

如圖2所示，檸檬酸濃度為0.15 mol/L時RS3得率達到最大。酸濃度過低，淀粉分子無法水解為合適的分子鏈長度，影響直鏈淀粉分子間的雙螺旋結(jié)構(gòu)生成。酸濃度過高，淀粉過度水解，分子鏈過短，小分子運動強烈，擴散速度快，不易形成有序結(jié)晶，RS3得率減少[17-19]。隨著加熱時間逐漸增加，RS3得率也隨之增大，當加熱時間達20 min時，RS3得率最大，之后開始下降。加熱時間過短，淀粉中直鏈分子未能完全游離出來，而加熱時間過長，直鏈分子水解過度，產(chǎn)生小分子質(zhì)量的直鏈淀粉，不易聚集結(jié)晶[17,20]。老化時間在36 h時RS3得率最大。老化時間短，晶核形成和晶體生長不完全，老化時間過長，淀粉糊黏度增大，晶體生長受抑制，直鏈淀粉難以重結(jié)晶，導(dǎo)致RS3得率下降。

圖2 超聲波酸熱處理對抗性淀粉含量的影響

2.2.2 正交實驗結(jié)果

正交實驗因素和水平如表3所示，正交實驗結(jié)果見表4。3個因素對RS3得率的影響的主次順序為：A(檸檬酸濃度)>B(加熱時間)>C(老化時間)。最佳工藝條件為A3B2C1，即檸檬酸濃度為0.15 mol/L，加熱時間為20 min，老化時間為24 h,RS3的得率最高，為40.672%。

表3 超聲波酸熱法制備大米抗性淀粉工藝條件正交實驗因素水平

表4 L9(34)正交實驗表

統(tǒng)計分析結(jié)果表明，在超聲波-濕熱法最佳工藝基礎(chǔ)之上結(jié)合酸水解明顯提高了RS3的得率。這是因為酸能進一步水解無定形支鏈淀粉，破壞支鏈淀粉的α-1,6鍵，同時對α-1,4鍵也有一定的裂解作用，使酸得以進一步滲入和水解并形成短直鏈淀粉，有利于RS3的生成。

2.3 大米抗性淀粉理化性質(zhì)

2.3.1 含水量

原大米淀粉、超聲波-濕熱法制備的RS3、超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的RS3的含水量分別是13.91%、9.24%、6.05%；超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的RS3含水量最低，更容易儲存，不容易變質(zhì)，保質(zhì)期更長；調(diào)漿時，更容易上漿，漿液濃度更準確。

2.3.2 溶解性

原大米淀粉、超聲波-濕熱法制備的RS3、超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的RS3的溶解性分別是5.16%、1.96%、0.25%。RS3在形成過程中，由于脫支化作用，使得抗性淀粉中直鏈淀粉含量大于原大米淀粉，且RS3抗性淀粉顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)比較致密，水分子不易進入，所以造成溶解性變小。超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的RS3溶解性最低，更易形成抗性淀粉[6,21]。

2.3.3 膨潤力

原大米淀粉、超聲波-濕熱法制備的RS3、超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的RS3膨潤力分別是0.667 6、0.611 1、0.580 3 g/g。RS3淀粉顆粒內(nèi)部由于結(jié)構(gòu)比較致密，水分子不易進入，持水力降低，所以導(dǎo)致膨潤力變小。超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的抗性大米淀粉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)更為致密，膨潤力最小[6,22]。

2.3.4 糊化性質(zhì)

糊化性質(zhì)表示了淀粉糊化的難易程度。由表5、圖3可知，超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的RS3的峰值黏度、保持黏度、最終黏度、回生值、衰減度與其他兩種淀粉相比值最低，呈現(xiàn)極顯著性差異，說明有較好的熱穩(wěn)定性。雖然峰值時間降低，但糊化溫度較原大米淀粉有所升高。超聲波-濕熱法制備的RS3峰值時間和糊化溫度均較原大米淀粉有升高。

由于在制備RS3的過程中的脫支化作用，分子間鍵發(fā)生斷裂而造成結(jié)構(gòu)脆弱，絕大部分轉(zhuǎn)化為取向單一的直鏈淀粉，且流動性大，所以造成了結(jié)果的差異[20-21,23]。

圖3 RVA特征曲線

2.3.5 偏光顯微觀察

淀粉顆粒內(nèi)部存在著結(jié)晶結(jié)構(gòu)和無定型結(jié)構(gòu)這兩種結(jié)構(gòu)，在結(jié)晶區(qū)淀粉分子鏈有序排列，而在無定型區(qū)淀粉分子無序排列，這兩種結(jié)構(gòu)在密度和折射率上存在差異，產(chǎn)生各向異性，從而偏振光通過淀粉顆粒時形成偏光十字。如圖4～圖6所示，原大米淀粉顆粒比較分散，很容易觀察到偏光十字，經(jīng)過超聲波-濕熱和酸水解處理后，淀粉顆粒都出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，雖然處理后淀粉的偏光十字依然存在，但超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解較超聲波-濕熱處理所制備的RS3更為分散，更容易看見偏光十字。

圖4 原大米淀粉

表5 三種淀粉間的RVA譜特征值差異

淀粉樣品峰值黏度保持黏度衰減度最終黏度回生值峰值時間糊化溫度A平均值 3 141 2 275 8663 877 1 602 6.0777.55 B平均值 1 005 8421631289 4477 92.2C平均值 24617472 3151415.53 79.9A變異系數(shù)/%15.4310.7712.43 6.69 11.442.9810.96B變異系數(shù)/% 7.616.4210.45 4.56 7.21 2.83 9.08C變異系數(shù)/% 6.10 4.34 5.14 5.65 9.32 2.24 11.44ta-b 7.27**8.07** 6.69** -15.92**-10.06**1.403.37**ta-c10.17**-5.37** 15.92** -18.68** -18.45**1.13 2.67**tb-c2.77* 2.15* 2.43*-2.49*-2.36* 2.46*1.25

注：*顯著性差異，**：極顯著性差異；A、B、C分別表示原大米淀粉、超聲波-濕熱法制得的RS3、超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制得的RS3；ta-b、ta-c、tb-c分別表示a與b、a與c、b與c之間 RVA 特征值的差異。

圖5 超聲波-濕熱法制備的RS3型大米抗性淀粉

圖6 超聲波-濕熱法結(jié)合酸水解制備的RS3型大米抗性淀粉

3 結(jié)論

超聲波-濕熱法制備RS3的最佳工藝條件：含水量30%、反應(yīng)溫度130 ℃、反應(yīng)時間10 h，RS3的得率達到32.173%，其中反應(yīng)溫度是影響得率的最主要因素。在此基礎(chǔ)上結(jié)合酸水解制備RS3最佳工藝條件：檸檬酸濃度0.15 mol/L、加熱時間20 min、老化時間24 h，RS3的得率達到40.672%，其中檸檬酸濃度是影響得率的最主要因素。

研究表明，在超聲波-濕熱法最佳工藝條件基礎(chǔ)上再進行酸水解，其所制備的RS3具有得率高、含水率低、易儲存、結(jié)構(gòu)致密、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點。