曹 鈺 ，潘慧青 ，陸 健 ，謝廣發(fā)

（1.江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；3.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；4.中國紹興黃酒集團有限公司國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興 312000）

黃酒是我國的特有酒種，以谷物（通常是糯米/粳米）為主要原料，利用酒藥和麥曲或米曲所含的豐富的微生物和酶為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)雙邊濃醪發(fā)酵釀造而成的發(fā)酵原酒[1]。

高級醇是各類酒的主要香味和口味物質(zhì)之一。適量的高級醇能使酒體豐富，口味協(xié)調(diào)，給人以醇厚的感覺。若高級醇含量過高，則對人體有毒害作用[2]。相比于其他發(fā)酵酒類而言，各種黃酒中高級醇的含量較多，也是導(dǎo)致黃酒容易“上頭”的主要原因之一[3]。在黃酒發(fā)酵過程中影響高級醇生成的因素有很多，主要包括：酵母菌種[4-5]、釀酒原輔料[5-6]、麥曲[7]、發(fā)酵工藝[8]（溫度、營養(yǎng)物質(zhì)主要是氮源含量的控制、接種量及增殖倍數(shù)）。但從本質(zhì)上來說，高級醇的形成不外乎2種途徑[1]：第一，若氨基酸缺失，酵母菌通過Harris途徑自身合成必需氨基酸，同時形成的α-酮酸中間體，被還原形成相應(yīng)的高級醇；第二，若氨基酸含量過多，酵母菌通過Ehilich降解途徑分解氨基酸，生成原氨基酸少一個碳的高級醇。由此可見高級醇的形成與發(fā)酵過程中的氨基酸代謝密切關(guān)聯(lián)[9]，吳春在研究黃酒風味物質(zhì)的形成及變化過程中證實發(fā)酵醪液中高級醇含量增加階段與氨基酸的含量大量增加期有明顯的一致性[10]。張興亞研究發(fā)現(xiàn)黃酒釀造中，隨著麥曲量的增加、后酵溫度的升高，高級醇與氨基酸態(tài)氮的變化趨勢相同，都呈升高趨勢[8]。

氨基酸在黃酒釀造過程中既為微生物提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，也是很多風味物質(zhì)的前體物質(zhì)，并能賦予酒體豐富的味覺層次。在整個黃酒釀造過程中氨基酸的含量是一個動態(tài)過程，一方面酵母菌等微生物的自身生長繁殖需要消耗一部分氨基酸，另一方面蛋白質(zhì)在多種蛋白酶肽酶的作用下不斷水解為氨基酸和小肽。黃酒行業(yè)采用氨基酸態(tài)氮來反映氨基酸及小肽的總體水平，氨基酸態(tài)氮含量是評價黃酒質(zhì)量等級重要指標[11]，國標對不同類型、不同等級黃酒中的氨基酸態(tài)氮含量有明確的要求。而黃酒的氨基酸態(tài)氮的形成同樣也受到原輔料、麥曲中的酶系、發(fā)酵工藝條件等復(fù)雜影響[12]，且影響因素之間可能存在著交互作用。

隨著人們對黃酒品質(zhì)和飲用健康性要求的不斷提高，降低黃酒中的高級醇含量并同時保留高等級標準氨基氮的優(yōu)質(zhì)黃酒受到極大的關(guān)注。作者前期已經(jīng)進行黃酒釀造工藝，包括接種量、前酵溫度、后酵溫度、后酵時間[13]等單因素對氨基酸態(tài)氮的影響研究。在綜合文獻資料和前期單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取對高級醇和氨基酸態(tài)氮影響較大的3個因素：前酵溫度、酵母接種體積分數(shù)及后酵溫度進行Box-Behnken實驗設(shè)計，探討降低高級醇質(zhì)量濃度并提高氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度的最優(yōu)釀造工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Saccharomyces cerevisiae N85，由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供；糯米，購于無錫市華潤萬家超市；生、熟麥曲，均由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供；乙腈，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；甲醇，北京白靈威科技有限公司產(chǎn)品，色譜純，其他試劑均為分析純。

UV-2100紫外分光光度計，Unic公司產(chǎn)品；凱氏定氮儀K2300，瑞典FOSS分析儀器有限公司產(chǎn)品；固相微萃取頭、手動進樣手柄，美國Supelco公司產(chǎn)品；Agilent GC7890A型氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 常規(guī)黃酒釀造

采用3 L的三角瓶發(fā)酵600 g糯米，釀造工藝流程如圖1。

圖1 黃酒釀造工藝流程Fig.1 Diagram of Chinese rice wine brewing

1.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

實驗采用自然浸米，發(fā)酵時間為21 d，選取前酵溫度、酵母接種體積分數(shù)和后酵溫度3個工藝條件作為影響因素進行Box-Behnken響應(yīng)面分析和優(yōu)化，因素水平設(shè)計見表1，響應(yīng)面實驗為同一批次進行，所用麥曲經(jīng)四分法取樣測得酸性蛋白酶活在112～118 U/g之間。

表1 響應(yīng)面因素設(shè)計水平表Table 1 Factors and 3 level value of response surface methodology

1.4 常規(guī)指標的測定

酒精度、總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮及非糖固形物的測定方法按照GB/T 13662-2008《黃酒》中規(guī)定方法執(zhí)行[11]。總氮的測定采用凱氏定氮法，參照凱氏定氮儀說明書。高級醇質(zhì)量濃度的測定參考李童[12]等人。

2 結(jié)果與分析

2.1 Box-Behnken實驗結(jié)果及方差分析

根據(jù)黃酒釀造工藝對氨基酸態(tài)氮和高級醇質(zhì)量濃度影響的單因素實驗結(jié)果[13]，前酵溫度、后酵溫度及酵母接種量3個因素的影響相對較大。選取前酵溫度26、28、30℃，酵母接種體積分數(shù)3%、5%、7%，后酵溫度13、15、17℃為影響因子水平，以高級醇含量和氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度為實驗指標，進行Box-Behnken響應(yīng)面分析，實驗設(shè)計結(jié)果見表2。

利用軟件Design-Expert8.0.6對表2進行多元回歸擬合，分別獲得高級醇質(zhì)量濃度Y1對自變量前酵溫度（A），酵母接種量（B）和后酵溫度（C）的三元多次回歸方程和氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度Y2對自變量的二元多次回歸方程如下。

Y1（高級醇）=410.33+33.05A+25.86B+21.64C-1.00AB+5.08AC+6.64BC-10.56A2-29.28B2-20.19C2-7.62A2B-3.09A2C-5.79AB2，R2=0.99。

Y2（氨基酸態(tài)氮）=0.92+0.08A-6.250×10-3B+0.046C-0.017AB-0.022AC+2.500×10-3A2-0.035B2-0.025C2，R2=0.99；

回歸診斷顯示，Y1和Y2回歸方程的決定系數(shù)（R2）均為 0.99，信噪比（Adequate Precision）分別為81.76和22.88，且二元多次回歸方程式的失擬值方差分析不顯著（P=0.28＞0.05），這些都表明方程的擬合度與可信度很高，誤差極小，能夠用模型分別對高級醇質(zhì)量濃度和氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度進行預(yù)測和分析。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計結(jié)果Table 2 Experiment design and results of Box-Behnken

由表3高級醇回歸模型方差分析可知，對高級醇的質(zhì)量濃度所建立的回歸模型極顯著（P=0.001 4＜0.01），因素 A、B、 C、A2、B2和 C2對高級醇質(zhì)量濃度的影響極為顯著（P＜0.01）；AC，BC，A2B 及 AB2對高級醇質(zhì)量濃度的影響為顯著（P＜0.05）；因素AB和A2C對高級醇質(zhì)量濃度的影響不顯著（P＞0.05）。

表3 高級醇的方差分析表Table 3 Variance analysis of Box-Behnken design about higher alcohols

表4 氨基酸態(tài)氮的方差分析表Table 4 Variance analysis of Box-Behnken design about amino nitrogen

氨基酸態(tài)氮回歸模型方差分析見表4，對氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度所建立的回歸模型極顯著 （P=0.000 3＜0.01），因素A對氨基酸態(tài)氮的影響最為顯著，其次因素 C 的影響極為顯著（P＜0.01）；AC，C2對氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響為顯著（P＜0.05）；因素B、AB、BC和A2對氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響不顯著（P＞0.05）。

2.2 因素交互作用的響應(yīng)面分析

2.2.1 前酵溫度、酵母接種量、后酵溫度的交互作用對高級醇的影響 前酵溫度和酵母接種量對高級醇的交互作用不顯著，如圖2所示。當前酵溫度不變時，隨著酵母接種體積分數(shù)的增大，高級醇的質(zhì)量濃度基本沒有發(fā)生較大改變。同樣，當酵母接種體積分數(shù)恒定時隨著前酵溫度的增加使得高級醇質(zhì)量濃度也未發(fā)生顯著變化。

前酵溫度與后酵溫度對高級醇的交互作用明顯。當前酵溫度不變時，隨著后酵溫度的增大使得高級醇質(zhì)量濃度增加；同樣，當后酵溫度保持不變時隨著前酵溫度的增大也使得高級醇質(zhì)量濃度增加。

圖2 前酵溫度、酵母接種體積分數(shù)與后酵溫度交互作用對高級醇的影響Fig.2 Response surface plots of effect of interaction between primary fermentation temperature and yeast inoculation size and post-fermentation temperature on higher alcohols in Chinese rice wine

酵母接種體積分數(shù)和后酵溫度對高級醇的交互作用顯著。當酵母接種體積分數(shù)不變時，隨著后酵溫度的不斷增大，高級醇質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先增多后稍微降低的趨勢；同樣，當后酵溫度保持不變時，隨著酵母接種體積分數(shù)的增大而高級醇質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先增多后降低的趨勢。因此，該條件下2因素的交互作用對高級醇質(zhì)量濃度影響較為顯著。

2.2.2 前酵溫度、酵母接種體積分數(shù)、后酵溫度的交互作用對氨基酸態(tài)氮的影響 前酵溫度和酵母接種體積分數(shù)對氨基酸態(tài)氮的交互不顯著，見圖3。當前酵溫度不變時，隨著酵母接種體積分數(shù)的增大，氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度基本沒有發(fā)生改變；僅當酵母接種體積分數(shù)恒定時隨著前酵溫度的升高使得氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度增多，此時前酵溫度起到主要影響作用。

圖3 前酵溫度、酵母接種體積分數(shù)與后酵溫度的交互作用對氨基酸態(tài)氮的影響Fig.3 Response surface plots of effect of interaction between primary-fermentation temperature and yeast inoculation size and post- fermentation temperature on amino nitrogen in Chinese rice wine

前酵溫度與后酵溫度對氨基酸態(tài)氮的交互作用明顯。當前酵溫度不變時，隨著后酵溫度的增大使得氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度增加；同樣，當后酵溫度保持不變時隨著前酵溫度的增大也使得氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度增加。

酵母接種體積分數(shù)和后酵溫度對氨基酸態(tài)氮的交互作用不顯著。當酵母接種體積分數(shù)不變時，隨著后酵溫度的不斷增大，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先增多后稍微降低的趨勢；但當后酵溫度保持不變時，隨著酵母接種體積分數(shù)的增大而氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度幾乎未發(fā)生變化。因此，該條件下因素后酵溫度對氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度影響較為顯著。

2.3 驗證性實驗

用軟件Design-Expert 8.0.6中的“Optimization”選項進行分析得出優(yōu)化結(jié)果，即同時獲得較低的高級醇質(zhì)量濃度及較高的氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度的發(fā)酵條件為：前酵溫度30℃，酵母接種體積分數(shù)3%和后酵溫度13℃，高級醇質(zhì)量濃度和氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度的計算預(yù)測值分別為343.33 mg/L和0.95 g/L。

采用優(yōu)化的工藝條件（前酵溫度30℃、酵母接種體積分數(shù)3%和后酵溫度13℃）進行發(fā)酵實驗，同時采用優(yōu)化前發(fā)酵條件（前酵溫度28℃、酵母接種體積分數(shù)5%、后酵溫度15℃）作為對比釀造實驗，以進一步驗證該方法的可靠性。分別做3個平行實驗，結(jié)果見表5。

表5 實驗設(shè)計的結(jié)果驗證Table 5 Validation of the experimental design results

優(yōu)化釀造的黃酒中高級醇質(zhì)量濃度平均值為355.43 mg/L，氨基酸態(tài)氮的平均值為0.98 g/L，驗證實驗的結(jié)果與理論預(yù)測值誤差小于3.50%，與優(yōu)化前相比高級醇降低了12.30%，氨基酸態(tài)氮提高了8.90%，其他黃酒理化指標均在正常范圍之內(nèi)。因此，采用響應(yīng)面方法優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝條件具有實際意義與實用價值，既能有效降低黃酒的高級醇質(zhì)量濃度，又可以提高氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度，確保黃酒的飲用安全和品質(zhì)等級。

3 結(jié)語

在黃酒發(fā)酵過程中高級醇的形成與氨基酸態(tài)氮代謝密切相關(guān)，兩者是成品酒中的重要理化指標。高級醇和氨基酸態(tài)氮的生成受到多種釀造工藝條件影響，且因素之間可能存在交互作用。在前期單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取前酵溫度、酵母接種體積分數(shù)及后酵溫度進行Box-Behnken響應(yīng)面實驗，用Design expert 8.0.6對實驗數(shù)據(jù)處理分析，并進行響應(yīng)面分析，探討這3個因素的交互作用對高級醇和氨基酸態(tài)氮的影響。

結(jié)果表明前酵溫度、后酵溫度以及前酵溫度和后酵溫度的交互作用對高級醇和氨基酸態(tài)氮的影響都是極顯著；酵母接種體積分數(shù)對高級醇的影響極顯著，但對氨基酸態(tài)氮的影響不顯著；酵母接種體積分數(shù)與后酵溫度的交互作用對高級醇影響顯著，但對氨基酸態(tài)氮影響不顯著；前酵溫度和酵母接種體積分數(shù)交互作用對兩者都不顯著。通過響應(yīng)面回歸分析，確定了降低高級醇質(zhì)量濃度同時提高氨基酸態(tài)氮的最優(yōu)工藝條件為：前酵溫度30℃，酵母接種體積分數(shù)為3%，后酵溫度為13℃。經(jīng)過驗證實驗，在此條件下釀造的黃酒中高級醇質(zhì)量濃度為355.43 mg/L，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度0.98 g/L，與優(yōu)化前相比高級醇降低了12.30%，氨基酸態(tài)氮提高了8.90%，有助于提高黃酒的品質(zhì)。