劉 靜，李 誠，胡迤蕭，杜 昕， 周恒量，劉愛平，辜 雨， 彭露露

（四川農(nóng)業(yè)大學 食品學院，四川 雅安 625014）

牦牛是我國特有的家畜之一，約1 400余萬頭，占世界總量的90%以上[1]。作為青藏高原高寒地區(qū)藏牧民不可缺少的生產(chǎn)生活資料[2]，具有不可替代的生態(tài)和經(jīng)濟地位[3]。牦牛肉是公認的“綠色食品”，已被廣泛開發(fā)利用，其加工副產(chǎn)物牦牛骨主要用于加工牦牛壯骨粉[4]、牦牛骨湯[5-6]等，未被深入研究。近年來，骨膠原多肽因其豐富的營養(yǎng)價值和生理功能成為當前研究的熱點，國內(nèi)外對于骨骼酶解的報道較多，集中在豬骨[7-8]、牛骨[9]、魚骨[10]等，酶解牦牛骨膠原蛋白的研究鮮見報道。大量研究表明：酶解動物骨蛋白得到的膠原多肽具有生物活性功能，如降血壓活性、抗腫瘤活性、抗氧化活性、預防與治療骨關節(jié)炎和骨質(zhì)疏松活性等，且大多的活性肽都是以相對分子質(zhì)量低于5 000的小分子肽存在，多肽具有良好的食品加工特性，而且有比氨基酸和蛋白質(zhì)更好的營養(yǎng)、吸收特性[11-14]。李帆等[15]以水解度為指標，探索木瓜蛋白酶水解牦牛骨的最佳條件，但水解度過高，蛋白質(zhì)可能被徹底水解成氨基酸從而喪失多肽的功能。因此，本實驗與現(xiàn)有的青海牦牛骨肽產(chǎn)品[16-17]生產(chǎn)工藝相比較，以四川九龍牦牛骨為原料，考察了不同種類的蛋白酶對酶解效果的影響，首次將可溶性多肽得率作為評價指標，彌補了單純提高水解度的不足；用響應面分析方法優(yōu)化制備牦牛骨小分子多肽得率最高的工藝條件，較大的縮短了酶解時間，并研究了酶解產(chǎn)物的加工功能特性，以期為進一步利用牦牛骨膠原多肽開發(fā)功能性產(chǎn)品以及探索牦牛骨多肽的生物活性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

四川九龍牦牛骨粉（200目）：四川大渡河食品有限公司產(chǎn)品；胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶：上海瑞永生物科技有限公司產(chǎn)品；福林酚法蛋白檢測試劑盒：南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

恒溫數(shù)顯水浴鍋：江蘇金城國勝實驗儀器廠制造；PHS-3C型酸度計：四川優(yōu)普科技有限公司產(chǎn)品；D-37520型冷凍離心機、Scientz-12型冷凍干燥機：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；QT-2型漩渦混合器：上海琪特分析儀器有限公司產(chǎn)品；UV-3200紫外分光光度計：上海美普達儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 牦牛骨蛋白的酶解工藝 稱取適量牦牛骨粉→按比例加水混合均勻→121℃條件下處理30 min，冷卻、調(diào)節(jié)pH→加酶水浴酶解→100℃滅酶10 min→10 000 r/min離心10 min→上清液過濾→牦牛骨蛋白酶解液→測定其可溶性多肽含量及水解度→冷凍干燥→牦牛骨多肽粉→加工特性測定。

1.3.2 最適蛋白酶種篩選試驗 分別選用胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對骨粉進行水解，以可溶性多肽得率為指標，篩選出水解度和可溶性多肽得率最高的酶。各酶的反應條件見表1。

表1 各蛋白酶反應條件Table 1 Reaction conditions of different enzymes

1.3.3 最優(yōu)酶酶解單因素試驗 將牦牛骨粉樣品按比例加入蒸餾水，分別在酶底比為2 000∶1、4 000∶1、6 000∶1、8 000∶1、10 000∶1、12 000∶1 （U/g），底物質(zhì)量濃度 1、2、3、4、5、6、7 g/dL，酶解時間 3、4、5、6、7 h，酶解溫度 40、45、50、55、60 ℃，pH 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10的條件下進行酶解單因素試驗，以多肽得率為主要指標，結合水解度篩選出最佳的酶解條件。

1.3.4 最優(yōu)酶酶解響應面試驗 在單因素實驗基礎上，選取底物質(zhì)量濃度、酶底比、pH、酶解時間4因素，以多肽得率作為響應值，采用Design expert 8.0.6Box-Behnken進行實驗設計和結果分析，探索制備可溶性多肽的最佳工藝。響應面設計如表2所示。

表2 響應面試驗因素設計表Table 2 Factors and levels of RSM experiment

1.3.5 酶解產(chǎn)物加工特性測定 對牦牛骨酶解產(chǎn)物的穩(wěn)定性、溶解性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性、乳化性及乳化穩(wěn)定性進行測定。

1.3.6 指標測定

1）酶活的測定：SB/T 10317-1999[18]

2）水解度的測定：中性甲醛滴定法[19]

吸取5 mL待測酶解液于250 mL燒杯中，加入60 mL蒸餾水，用磁力攪拌器攪拌并滴加0.05 mol/L NaOH標準溶液至溶液pH顯示8.2立刻加入5 mL甲醛，再邊攪拌邊滴加0.05 mol/L NaOH標準溶液至溶液pH變?yōu)?.2，記錄加入甲醛后消耗的NaOH標準溶液的體積V（mL）。

式中：N0為總氮質(zhì)量濃度 （g/dL）；N1為酶解前游離氨基氮質(zhì)量濃度（g/dL）；N2為酶解后游離氨基氮質(zhì)量濃度（g/dL）。

3）可溶性多肽得率測定：使用福林酚法蛋白含量檢測試劑盒，根據(jù)魯偉[20]的方法略作修改。

樣品的處理：取一定體積的酶解液于離心管中，加入等體積的10 g/dL三氯乙酸（TCA）水溶液，混勻，靜置 10 min，4 000 r/min下離心 15 min，取上清液備用。標準蛋白質(zhì)溶液、堿性銅試劑工作液按試劑盒說明書配置。標準曲線的制作：取6支帶蓋1.5 mL離心管，按表3順序加入試劑。

表3 標準曲線制作表Table 3 Steps of making standard curve

加入福林酚試劑混勻后于20～25℃放置30 min在750 nm下比色，以蛋白質(zhì)質(zhì)量為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

4）樣品多肽質(zhì)量的測定：取20 μL樣品溶液，按表3方法測出其吸光度值，通過標準曲線計算出樣品中多肽的質(zhì)量。

其中，M為氮溶指數(shù)；M1為濾液中的含氮質(zhì)量分數(shù)；M2為樣品總含氮質(zhì)量分數(shù)。

6）穩(wěn)定性：參考趙玉紅[22]的方法，將20 mg樣品溶于10 mL 0.1 mol/L NaCl溶液中，調(diào)解pH 7。于121℃高壓蒸汽滅菌20 min后測含氮質(zhì)量分數(shù)。

其中，I為可溶性的肽得率；m1為上清液中的肽質(zhì)量；m0為總蛋白質(zhì)質(zhì)量。

5）溶解性：參考 Giménez B[21]的方法，將 20 mg樣品溶于10 mL 0.1 mol/L NaCl溶液中，調(diào)解pH 7，于30℃恒溫搖床放置60 min，過濾，用少量蒸餾水洗殘渣。氮質(zhì)量分數(shù)用凱氏定氮儀進行分析。氮溶指數(shù)表示溶解性。

其中，W為穩(wěn)定性，%；W1為處理后的氮質(zhì)量分數(shù)；W0為處理前的氮質(zhì)量分數(shù)。

7）起泡性及起泡穩(wěn)定性：參考曾慶祝[23]的方法，取5 mL 20 mg/mL樣品溶液于100 mL離心管中，20 000 r/min勻漿90 s后記泡沫體積V1；室溫放置30 min記泡沫體積V2。

8）乳化性及乳化穩(wěn)定性：參考于泓鵬[24]的方法，取20 mL 60 mg/mL樣品溶液調(diào) pH 7.0，加入20 mL精制大豆油混合后8 000 r/min均質(zhì)2 min，等量分成2份分別倒進離心管和試管中。將離心管中的乳濁液在1 500 g下離心5 min，記錄離心后乳化層體積V1和總體積V0。試管中的乳濁液于80℃保溫15 min，取出冷卻至室溫后1 500 g離心5 min記錄乳化層體積V2。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)為3組數(shù)據(jù)平均值，采用Excel 2007和Design Expert 8.0進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結果與分析

2.1 酶篩選試驗

不同蛋白酶對牦牛骨的酶解效果見圖1。由圖1可知胃蛋白酶的水解度最高，依次是胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶最低。水解度高的原因可能是酸性環(huán)境有利于鈣的溶出，使水解加深，也加大羥基磷灰石與溶液的接觸面積從而增加鈣的溶出造成雙向促進[22]。但是胃蛋白酶解液中可溶性多肽的得率不高，可能是水解較為徹底，溶液中氨基酸得率較高而多肽得率并不高。堿性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶的可溶性多肽得率都較高，其中堿性蛋白酶最高，為18.13%。堿性蛋白酶酶活高，商業(yè)成本低，并且能夠得到盡可能多的可溶性多肽，綜合考慮，試驗選取堿性蛋白酶作為試驗最適酶制劑。

圖1 各蛋白酶水解效果比較Fig.1 Hydrolysis effects of different kinds of enzymes

2.2 最適酶單因素試驗

2.2.1 底物質(zhì)量濃度對酶解效果的影響 在酶底比6 000 U/g，酶解溫度55℃，酶解pH 8.5的條件下酶解5 h，考察底物對酶解效果的影響，結果如圖2所示，酶解液水解度隨酶底比的增加呈上升趨勢，在3%以后上升較緩，5%時達到最大值后隨底物質(zhì)量濃度增大水解度減小。多肽得率隨底物質(zhì)量濃度的增加呈減小趨勢，在4%后逐漸趨于平衡。底物質(zhì)量濃度呈一定比例增加，溶液中的可溶性多肽質(zhì)量分數(shù)增多，但其增加的比例小于底物增加的比例，這可能是導致得率逐漸減少的主要原因，而底物質(zhì)量濃度過低降低試驗效率，增加成本，綜合考慮，底物質(zhì)量濃度范圍選取3～5 g/dL。

2.2.2 酶底比對酶解效果的影響 在底物質(zhì)量濃度6 g/dL，酶解溫度55℃，酶解pH 8.5的條件下酶解5 h，考察酶底比對酶解效果的影響，結果如圖3所示，水解度和多肽得率都隨酶底比增加呈先增大后減小的趨勢，水解度在6 000 U/g時達到最大為29.94%，多肽得率在4 000 U/g處達到最大值15.26%后緩慢下降。反應初始階段，增加酶的質(zhì)量分數(shù)，使酶和底物充分反應，水解度和可溶性多肽得率增大，而當酶增加到與底物反應達到飽和時，再增大加酶量并不會促進蛋白的水解，造成酶的浪費，因此，酶底比范圍選取4 000～8 000 U/g較為合適。

圖2 底物質(zhì)量濃度對酶解效果的影響Fig.2 Influence of substrate content on hydrolysis

圖3 酶底比對酶解效果的影響Fig.3 Influence of enzyme/substrate on hydrolysis

2.2.3 酶解時間對酶解效果的影響 在底物質(zhì)量濃度6 g/dL，溫度55℃，pH 8.5，酶底比6 000 U/g的條件下考察酶解時間對酶解效果的影響，結果如圖4所示，在3 h時，兩者已經(jīng)處于較大值，后隨時間的增加，二者都先上升后逐漸趨于平衡，最后水解度穩(wěn)定在26%左右，可溶性多肽得率在4 h時達到最大14.37%。在酶解的初始階段，酶解反應劇烈，水解度增大，可溶性多肽得率也增大，隨著水解的進行，當?shù)鞍踪|(zhì)水解為多肽的速度小于多肽水解為氨基酸的速度時，多肽得率就會緩慢下降，最后當酶促反應達到動態(tài)平衡水解度和多肽含量也趨于平衡。所以，酶解時間選取3～5 h。

圖4 酶解時間對酶解效果的影響Fig.4 Influence of time on hydrolysis

2.2.4 酶解pH對酶解效果的影響 在底物質(zhì)量濃度6 g/dL，酶解溫度55℃，酶底比6 000 U/g的條件下酶解5 h，考察酶解pH對酶解效果的影響結果如圖5所示，水解度和多肽得率隨pH的增大變化不明顯，最高值分別為24.36%和13.61%。環(huán)境pH會影響酶分子的構象和酶及底物的解離狀態(tài)，酶活性部位只有在酶蛋白保持一定的空間構象時才能體現(xiàn)出最大的催化功能，以此影響酶活性和酶促反應速度，從結果看來堿性蛋白酶在試驗pH環(huán)境下均能較好的催化水解反應，而過高的pH對設備存在一定的腐蝕性也會引入較多的雜離子，所以pH范圍考慮 7～9。

圖5 酶解pH對酶解效果的影響Fig.5 Influence of pH on hydrolysis

2.2.5 酶解溫度對酶解效果的影響 在底物質(zhì)量濃度6 g/dL，酶解pH 8.5，酶底比6 000 U/g的條件下酶解5 h，考察酶解溫度對酶解效果的影響結果如圖6所示水解度在50℃、多肽得率在45℃時達到最大值，分別為26.38%、16.62%。二者隨溫度升高變化不明顯，不同水浴環(huán)境下并不能完全控制溫度的差異值，考慮到實驗環(huán)境的具體影響，選取酶解溫度為50℃。

圖6 酶解溫度對酶解效果的影響Fig.6 Influence of temperature on hydrolysis

從以上結果可以看出，底物質(zhì)量濃度對水解度和多肽得率的影響是顯著的，其次是酶底比和酶解時間，酶解溫度與pH最不明顯，而當水解度處于最大值時，多肽得率并非最高，二者不呈明顯的線性關系。水解度越高，水解越徹底，蛋白質(zhì)水解得到的多肽可能被進一步水解為氨基酸，導致得率降低，所以在響應面優(yōu)化試驗時選取多肽得率為主要指標進行評價。

2.3 最適酶響應面優(yōu)化試驗

2.3.1 響應面模型建立與方差分析 采用Design Expert 8.0軟件按照表2的編碼水平共設計29組試驗，結果見表4。

表4 響應面設計方案及試驗結果Table 4 Results for response surface analysis

采用Design Expert 8.0軟件對表4所示的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合和顯著性檢驗，結果見表5。以多肽得率為Y值，得到回歸方程Y=19.43-1.56A-1.14B-0.34C+1.38D+0.07AB+0.84AC-0.45AD+1.12BC+1.85BD+0.13CD-2.29A2-0.37B2+0.38C2-0.74D2。對回歸方程進行失擬性檢驗得F=0.86，P=0.616 5＞P=0.05差異不顯著。對回其進行顯著性檢驗，F(xiàn)=27.95，P＜0.000 1，極顯著。 相關系數(shù) R2=0.965 5，R2adj=0.930 9說明回歸方程與實際情況擬合較好，使用該模型進行分析是可靠的。從表5還可以看出， 模型中，A、B、D、AC、BC、BD、A2、D2對得率影響顯著，其中 A（底物質(zhì)量濃度）、B（酶底比）、D（酶解時間）、BD（酶底比和酶解時間的交互作用）極顯著。各因素影響順序為：底物質(zhì)量濃度＞酶解時間＞酶底比＞pH。

表5 試驗結果及方差分析Table 5 Variance analysis for fitted regression model

2.3.2 因素間交互影響 從表5可看出AC、BC、BD之間的交互作用對多肽得率的影響是顯著的，由方程模型所做的響應面曲面圖見圖7～9。如圖7～9所示，響應值對底物質(zhì)量濃度的變化最敏感，表現(xiàn)為曲面較陡，其次是酶解時間和酶底比的相互影響，隨兩者的增大，底物和酶接觸得更充分，水解更徹底，生成的肽被進一步水解可能是多肽得率減小的主要原因。響應值對酶底比和pH的相互作用變化較不明顯，與表5的結果一致。

2.3.3 響應面模型驗證試驗 由回歸方程預測得到最佳酶解條件是底物質(zhì)量濃度3.49 g/dL，酶底比4 000 U/g，pH 7.0，酶解時間 3.75 h，此時多肽得率為22.74%，為方便驗證，將參數(shù)修正為底物質(zhì)量濃度 3.5 g/dL，酶底比 4 000 U/g，pH 7.0，酶解時間4 h，此條件下制備的牦牛骨多肽得率為22.06%，接近于理論值，回歸方程可用于實踐。

圖7 底物質(zhì)量濃度與pH交互影響多肽得率的響應曲面圖Fig.7 Effects of substrate content，pH on polypeptide yield

圖8 時間與酶底比交互影響多肽得率的響應曲面圖Fig.8 Effects of timeand enzyme/substrate on polypeptide yield

圖9 pH與酶底比交互影響多肽得率的響應曲面圖Fig.9 Effects of pH and enzyme/substrate on polypeptide yield

2.4 酶解產(chǎn)物加工功能特性測定

牦牛骨酶解產(chǎn)物的加工功能特性測定結果見表6。

表6 牦牛骨酶解產(chǎn)物加工功能特性Table 6 Processing functional properties of Yak hy drolysates

從表6可以看出，牦牛骨的酶解產(chǎn)物具有良好的溶解性、穩(wěn)定性和起泡性，但是起泡穩(wěn)定性較差，靜置30 min后的泡沫體積明顯減少，乳化性和乳化穩(wěn)定性一般，乳化性與肽鏈長短有關，為了提高多肽的得率，試驗所制備的酶解液的肽鏈較短，而要獲得良好的乳化性則需要120個氨基酸殘基[25]，推測是乳化性一般的主要原因。結果與Li&Fan[26]略有差異，可能與酶解原料和產(chǎn)物純度有關。

3 結 語

堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶等不同酶種對酶解液多肽得率和水解度的影響表明試驗最適用酶為堿性蛋白酶。單因素實驗考察了底物質(zhì)量濃度、酶底比、酶解時間、pH、酶解溫度這5個因素對酶解液水解度和多肽得率的影響，結合Box-Behnken模型響應面法優(yōu)化牦牛骨多肽制備工藝，得到最佳酶解條件為底物質(zhì)量濃度 3.5 g/dL，酶底比 4 000 U/g，pH 7.0，酶解時間4 h，此時多肽得率為22.06%。對酶解液加工功能測定，表明其溶解性、穩(wěn)定性、起泡性良好，分別是81%、58.9%、92.4%，乳化性和乳化穩(wěn)定性分別為24.33%、33.7%，為牦牛骨多肽在食品加工中的應用提供了實驗依據(jù)。