羅 云，王鎮(zhèn)發(fā)，梅 勝，陳培欽，李夏蘭*

（1.華僑大學 化工學院，福建 廈門 361021；2.漳州市龍文區(qū)環(huán)境保護監(jiān)測站，福建 漳州363005）

阿魏酸酯酶 （EC 1.1.73，feruloyl esterase，F(xiàn)AE）是降解木質(zhì)纖維的關鍵酶之一，阿魏酸酯酶在飼料中的應用引起了廣泛關注。李夏蘭等[1]研究發(fā)現(xiàn)在降解木質(zhì)纖維時，F(xiàn)AE和木聚糖酶存在協(xié)同作用，將麥糟中阿魏酸 （4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，ferulic acid，F(xiàn)A）的釋放量提高到 0.97 mg/g（干麥糟），低聚木糖（xylooligosaccharides，XOS）的釋放量達到 161 mg/g（干麥糟）。據(jù)報道，F(xiàn)AE產(chǎn)生菌與纖維素酶共同添加到青貯飼料中，對青貯飼料的有氧穩(wěn)定性、纖維素降解率，飼料營養(yǎng)價值以及動物的生產(chǎn)性能和消化性能都會產(chǎn)生積極影響[2-5]。但是大多數(shù)直接添加FAE產(chǎn)生菌到青貯飼料的作用效果不穩(wěn)定，對部分營養(yǎng)價值的影響不顯著。楊道秀等[6]和王林林等[7-8]將FAE粗酶液直接添加到雞飼料中發(fā)酵，酶化發(fā)酵飼料的營養(yǎng)價值、對肉雞的生產(chǎn)性能和消化性能都有顯著影響。鑒于直接添加FAE產(chǎn)生菌對青貯飼料效果的不穩(wěn)定性，以及肉雞采食量小，腸道較短，不能充分體現(xiàn)FAE酶化發(fā)酵飼料對大型單胃動物生產(chǎn)性能和消化性能的影響，本試驗將FAE與含乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌等的飼料發(fā)酵劑共同作用，探究FAE對飼料的營養(yǎng)價值的影響，以及對三元豬的生產(chǎn)性能、消化性能和經(jīng)濟效益的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

漳州市南靖縣靖城鎮(zhèn)養(yǎng)殖場進行125 d喂養(yǎng)試驗，選用 81頭公母對半、出生日齡（80±2）d、體質(zhì)量15～18 kg的健康（杜×長×大）三元雜交斷奶仔豬，隨機分成A、B、C 3組，每組3個平行，每個平行9頭。A組為基礎飼糧組，飼喂普通飼料；B組為發(fā)酵飼料組，飼喂混有質(zhì)量分數(shù)12%例發(fā)酵飼料的基礎飼糧；C組為酶化發(fā)酵飼料組，飼喂含有質(zhì)量分數(shù)12%酶化發(fā)酵飼料的基礎飼糧。飼養(yǎng)期間密切注意豬的精神狀態(tài)、進食量與速度、腹瀉頭數(shù)和次數(shù)、生病頭數(shù)與次數(shù)，記錄豬的采食量。試驗期間每天08：00和16：00各飼喂1次，飼料計量不限重，以食槽無剩余料為原則。保證充足的清潔飲水，對豬舍每天打掃2次，按常規(guī)飼養(yǎng)和免疫，全程無使用抗生素藥物。

基礎飼糧配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet（air-dry basis） %

1.2 試驗材料

1.2.1 主要儀器 超濾膜裝置（截留相對分子質(zhì)量10×103），上海摩速科學器材有限公司產(chǎn)品；發(fā)酵袋，順德沃進塑料制品廠制造；1100高效液相色譜儀，美國Agilant公司產(chǎn)品；HPX-42A柱，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；ODS-C18柱，美國Thermo公司產(chǎn)品；UV-6100紫外可見光分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產(chǎn)品；2.5-12A馬弗爐，浙江杭州藍天化驗儀器廠制造。

1.2.2 主要原料 反式阿魏酸標準樣品，美國Sigma公司產(chǎn)品；阿魏酸甲酯標準樣品，Alfa Aesar公司產(chǎn)品；XOS標準品、木二糖標準品，日本和光純藥工業(yè)株式會社產(chǎn)品；總氨基酸測定試劑盒、乳酸測定盒試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；麩皮、次粉，中糧集團廈門海嘉面粉有限公司產(chǎn)品；玉米蛋白飼料，山東濱州海星飼料廠制造；瓜爾豆粕，廣饒六合化工有限公司產(chǎn)品；棕櫚仁粕，大連鎂達國際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；預混料，廈門百穗行科技有限公司產(chǎn)品；發(fā)酵劑1×1010 CFU/g，山東寶來利來生物工程公司產(chǎn)品；杏鮑菇菌柄，福建嘉勝集團大建飼料有限公司產(chǎn)品。

1.3 發(fā)酵飼料制備

1.3.1 FAE粗酶液的制備 菌種：黑曲霉，實驗室自行篩選并保藏。

種子培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，36℃，200 r/min培養(yǎng)2 d。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮與次粉1∶1混合物質(zhì)量分數(shù)39.30%，水質(zhì)量分數(shù)58.20%，硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)0.06%，硫酸銨質(zhì)量分數(shù)2.44%。采用白瓷盤固體發(fā)酵，33℃培養(yǎng)6 d。

粗酶液的制備：固體發(fā)酵料中加入8倍體積的蒸餾水，33℃，180 r/min抽提2.5 h，用8層紗布過濾，濾液超濾濃縮。

1.3.2 發(fā)酵飼料和酶化發(fā)酵飼料的制備 飼料配方（以干物質(zhì)計，質(zhì)量分數(shù)）：玉米蛋白飼料26%，菌柄12%，谷殼粉16%，棕櫚仁粕11%，瓜爾豆粕5%，玉米粉5%，糖蜜0.3%，發(fā)酵劑0.1%，水24.7%。

發(fā)酵飼料的制備：按質(zhì)量分數(shù)0.1%的比例將發(fā)酵劑菌種加入飼料配方中，充分混勻，采用帶有單向排氣閥的飼料發(fā)酵袋進行常溫發(fā)酵。每袋裝料量為40 kg，1個月后鑒定其營養(yǎng)品質(zhì)。

酶化發(fā)酵飼料的制備：按8 U/g干菌柄將FAE添加于飼料原料中（酶液所占質(zhì)量從水中扣除），再加入質(zhì)量分數(shù)0.1%發(fā)酵劑，充分混勻，采用帶有單向排氣閥的發(fā)酵袋常溫發(fā)酵。每袋裝料量為40 kg，發(fā)酵1個月后鑒定其營養(yǎng)品質(zhì)。

1.4 飼料和糞便中指標測定

1.4.1 飼料和糞便中常規(guī)指標測定 粗蛋白質(zhì)含量按 《GB/T 6432-1994飼料中粗蛋白質(zhì)測定方法》分析[9]；粗纖維含量按《GBT-6434-2006飼料中粗纖維測定方法》分析[10]；中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）含量按《GB/T 20806-2006 飼料中中性洗滌纖維的測定》分析[11]；酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量按《NY/T 1459-2007飼料中酸性洗滌纖維的測定》分析[12]；酸性洗滌木質(zhì)素（acid detergent lignin，ADL）含量按《GB/T 20805-2006飼料中酸性洗滌木質(zhì)素的測定》分析[13]；總糖含量按 《GB/T 15672-2009食用菌中總糖含量的測定》分析[14]。

1.4.2 FA、XOS、總氨基酸和乳酸測定 總氨基酸含量試劑盒測定，原理為銅離子與氨基酸的顯色反應；乳酸含量采用試劑盒測定，原理為乳酸脫氫酶的顯色反應。按文獻[1]的方法檢測FA和XOS，F(xiàn)A含量測定采用HPLC法：色譜柱為ODS-C18柱，318 nm檢測，柱溫35℃，流動相為甲醇∶水∶冰醋酸=30∶69.5∶0.5（V/V/V），流速為 1 mL/min，XOS 含量測定采用HPLC法：色譜柱為Aminex HPX-42A柱，柱溫85℃，示差折光檢測器，流動相為超純水（超聲波脫氣 1 h），流速 0.6 mL/min。

1.4.3 總菌數(shù)和乳酸菌數(shù)測定 細菌總數(shù)按《GB/T 13093-2006飼料中細菌總數(shù)的測定》分析[15]；乳酸菌總數(shù)按 《GB 4789.35-2010食品安全國家標準食品微生物學檢測乳酸菌檢測》分析[16]。

1.4.4 飼料衛(wèi)生檢測和豬肉品質(zhì)檢測 飼料和豬肉送至福建省分析檢測中心。飼料樣品按《GB 13078-2001飼料衛(wèi)生標準》分析[17]，豬肉樣品按《GB 2707-2005《鮮（凍）畜肉衛(wèi)生標準》分析[18]。

1.5 三元豬測試指標及測定方法

平均日增重：以頭為單位分別稱取試驗期間試驗豬的始重和末重，稱重前10 h禁食，計算平均日增重；平均日采食量：記錄各組每天的投料量，觀察試驗豬采食情況，計算平均日采食量；腹瀉率：觀察和記錄各組試驗豬的腹瀉頭數(shù)和天數(shù)。

其中，I為腹瀉率；N為腹瀉頭數(shù)；M為腹瀉天數(shù)；N0為總頭數(shù)；M0為總天數(shù)。

腹瀉評分標準見表2[19]。

表2 腹瀉評分標準Table 2 Grading criteria of diarrhea

糞便收集：當豬生長到育肥期時，進行10 d的糞便采集。前7 d為預試期，后3 d為收糞期。從第8 天開始，每日 06：30～08：30 和 16：30～18：30，將各欄內(nèi)糞便混勻，取1 000 g糞便樣品，加入100 mL質(zhì)量分數(shù)10%的HCl，混勻后于-20℃冰箱中保存。第10天將各欄3 d糞便混合，待測；消化率測定：采用鹽酸不溶性灰分（ash insoluble hydrochloric acid，AIA）為內(nèi)源性指示劑，計算各組粗蛋白質(zhì)、NDF、ADF、ADL、干物質(zhì)、粗灰分的消化率；飼料報酬：記錄試驗期內(nèi)各組飼料的總耗量、飼料費用、豬的總增重，計算飼料報酬。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件的ANOVA進行方差分析，Duncan法進行多重比較，各組數(shù)據(jù)以平均值±標準差（mean±SE）表示。

2 結果與分析

2.1 FAE對飼料品質(zhì)的影響

2.1.1 FAE對飼料感官品質(zhì)的影響 酶化發(fā)酵飼料為棕黃色，具有芳香的酒糟味，酸味濃而不刺鼻，給人以舒適的嗅感，手摸后味道容易洗掉；袋內(nèi)壓得非常緊密，拿到手上較松散、略濕潤、清爽；飼料顆粒均勻。發(fā)酵飼料所產(chǎn)生的酸味很濃烈，但不刺鼻，香味淡，呈金黃色；袋內(nèi)壓得緊密，拿到手上松散，手感略顯粗糙；飼料顆粒均勻。酶化發(fā)酵飼料因加入了黑曲霉固態(tài)發(fā)酵得到的粗酶液，使其飼料顏色略深，且酵化發(fā)酵飼料明顯更具芳香味。發(fā)酵飼料所測定的易揮發(fā)性物質(zhì)和水分質(zhì)量分數(shù)為33.17%，比酶化發(fā)酵飼料易揮發(fā)性物質(zhì)與水分質(zhì)量分數(shù)低12.17%，使得發(fā)酵飼料手感略粗糙，不夠柔軟。

表3 FAE對飼料感官品質(zhì)的影響Table 3 Effects of FAE on sensory quality of feed（n=3）

2.1.2 FAE對飼料組成的影響 由表4可知，酶化發(fā)酵飼料與發(fā)酵飼料相比，ADF與NDF的降解率分別提高了5.13%、25.31%，具有顯著差異 （P＜0.05）；酶化發(fā)酵飼料中總氨基酸、FA和XOS的質(zhì)量分數(shù)分別比發(fā)酵飼料提高了1.71、2.33和1.88倍，具有顯著差異（P＜0.05）；單位飼料中細菌總數(shù)、乳酸菌總數(shù)的含量大大提高，分別提高了104倍和103倍，具有顯著差異（P＜0.05）。這是由于FAE可以與枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)生的木聚糖酶協(xié)同作用，降解木質(zhì)纖維中的碳骨架，使酶化發(fā)酵飼料中的纖維降解率提高，釋放了XOS和FA，XOS有利于益生菌的增殖，且代謝過程中不斷增加的游離氨基酸、小分子肽等物質(zhì)也可以有效促進有益菌的繁殖。酶化發(fā)酵飼料中細菌總數(shù)與乳酸菌總數(shù)的含量顯著高于發(fā)酵飼料（P＜0.05），但是乳酸菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌等有益菌大量繁殖的同時并沒有降低飼料中總糖的含量。但發(fā)酵飼料中乳酸質(zhì)量分數(shù)（6.21 mg/g）高于酶化發(fā)酵飼料中乳酸質(zhì)量分數(shù)（3.99 mg/g），具有顯著差異（P＜0.05）；發(fā)酵飼料 pH 4.11與酶化發(fā)酵飼料pH 4.27也具有顯著差異 （P＜0.05）。

表4 FAE對飼料組成的影響Table 4 Effects of FAE on feed composition（n=3）

2.1.3 飼料衛(wèi)生指標檢測 經(jīng)檢測，酶化發(fā)酵飼料的各項衛(wèi)生指標如表5所示，均符合 《GB 13078-2001飼料衛(wèi)生標準》要求。

2.2 酶化發(fā)酵飼料對三元豬腹瀉率的影響

在試驗全程中，按照常規(guī)免疫，未添加任何抗生素及其他藥物，各組試驗豬的成活率100%，C組的腹瀉率比A組和B組分別低0.35%和0.21%，差異顯著（P<0.05），見表6。

表5 酶化發(fā)酵飼料衛(wèi)生檢測報告Table 5 Hygiene inspection report of enzymatic fermentad feed

表6 FAE對三元豬腹瀉率的影響Table 6 Effect of FAE on the diarrhea rate of pigs

2.3 酶化發(fā)酵飼料對三元豬生產(chǎn)性能的影響

由表7可知，與A組和B組相比，C組的平均日采食量分別提高了41.10%和15.73%，差異顯著（P<0.05）。C組的平均日增重與A組和B組相比分別提高了26.15%和17.14%，差異顯著（P<0.05）。與A組比較，B組的平均日采食量提高了21.92%，差異顯著（P<0.05）。與A組比較，C組和B組的料重比分別提高了11.56%和12.89%，差異顯著（P<0.05）。

表7 FAE對三元豬生產(chǎn)性能的影響Table 7 Effects of FAE on pig's growing performance

2.4 酶化發(fā)酵飼料對三元豬表觀消化率的影響

飼料表觀消化率的測定采用AIA為內(nèi)源性指示劑，其回收率為102.15。由表8可知，與A組比較，B組和C組對干物質(zhì)的利用率分別提高了0.31%和 0.35%，差異顯著（P<0.05）；與 A 組比較，B組和C組對NDF的消化率分別提高了9.39%和10.34%，差異顯著（P<0.05）；對于 ADF 的消化率，B組和C組比A組分別提高了60.59%和79.95%，差異極顯著（P＜0.01）；對于粗灰分的消化率，B組和C組與A組相比分別提高了12.65%和20.61%，差異顯著（P＜0.05）。C組與B組相比，對粗灰分的消化率提高了7.06%，具有顯著差異（P＜0.05）。B組和C組對三元豬纖維素和干物質(zhì)的消化率作用不顯著，可能是由于在飼料貯存和發(fā)酵過程中已降解了一部分纖維素，同時豬的胃腸中缺少能夠進一步協(xié)同降解木質(zhì)纖維的其他酶類。

2.5 酶化發(fā)酵飼料報酬分析

由于發(fā)酵飼料中添加了飼料發(fā)酵劑，其飼料價格比基礎飼糧組增加了6.82%，酶化發(fā)酵飼料中添加了飼料發(fā)酵劑和FAE粗酶液，其飼料價格比基礎飼糧組增加了15.91%。試驗期間，C組平均每頭豬的飼料費用、重質(zhì)量和毛利比A組分別增加了63.54%、26.15%和 6.62%，具有顯著差異（P＜0.05）。從表9可知，C組雖然提高飼料的料重比，但其通過改善飼料的風味，提高飼料的適口性，增加其采食量和日增重，從而可縮短飼喂周期，提高經(jīng)濟效益。

2.6 豬肉安全檢測

經(jīng)檢測，飼喂酶化發(fā)酵飼料豬的鮮肉衛(wèi)生指標如表10所示，均符合《GB 2707-2005《鮮（凍）畜肉衛(wèi)生標準》要求。

表8 FAE飼料對養(yǎng)分表觀消化率的影響Table 8 Effects of FAE on nutrient apparent digestibility %（質(zhì)量分數(shù)）

表9 飼料報酬分析Table 9 Remuneration analysis of feed

表10 飼喂酶化發(fā)酵飼料豬的鮮肉衛(wèi)生檢測報告Table 10 Hygiene inspection report of pig meat feeding enzymatic fermentrd feed

3 討論

3.1 FAE與發(fā)酵劑的相互作用及其對飼料發(fā)酵的影響

酶化發(fā)酵飼料采用了黑曲霉固態(tài)發(fā)酵得到的FAE粗酶液與微生態(tài)發(fā)酵劑共同作用，其中發(fā)酵菌株主要有枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸桿菌。在酶化發(fā)酵飼料中FAE和發(fā)酵劑中微生物所分泌的木聚糖酶協(xié)同作用，提高菌柄中抗營養(yǎng)因子的降解效率，同時產(chǎn)生FA和XOS。隨著微生物菌群的大量繁殖，與發(fā)酵飼料相比，微生物所分泌的酶也相對增加，飼料中蛋白質(zhì)、纖維素、糖類等大分子物質(zhì)降解率也相對提高，同時一些寡糖、小分子肽、有機酸等不斷積累。XOS功能性小分子物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進發(fā)酵菌群的生長，促進畜禽生長等作用，在一定程度上替代了飼用抗生素的作用[20]。

3.2 FAE酶化發(fā)酵飼料對三元豬生產(chǎn)性能的影響

所研制的FAE酶化發(fā)酵飼料，提高了飼料風味，改善適口性，促進畜禽采食，增強生產(chǎn)性能。這是因為：一是發(fā)酵飼料中有大量益生菌且產(chǎn)生的XOS增殖益生菌，可以競爭性抑制畜禽腸道中有害菌定植；二是實驗觀察到，酶化發(fā)酵飼料明顯更具芳香味，這是飼料中的微生物可能將釋放的FA轉(zhuǎn)化成香草酸和香草醛等飼料風味物質(zhì)[21-22]。

此類芳香類物質(zhì)，更明顯提高飼料風味，改善適口性，促進畜禽采食，增強生產(chǎn)性能。本試驗結果表明，F(xiàn)AE酶化發(fā)酵飼料可以顯著提高三元豬的平均日增重和平均采食量。Salem等[23-25]提到添加培養(yǎng)基中的代謝活性成分，酶制劑和微生物發(fā)酵劑可以改善飼料的風味，增加采食量，提高飼料營養(yǎng)價值，促進畜禽的生長性能和消化性能。王林林等[8]用阿魏酸酯酶酶化發(fā)酵飼料飼喂肉雞，肉雞的日增重提高了6.42%，料重比降低了11.34%。此外，酶化發(fā)酵飼料組降低了腹瀉率，從而也提高了經(jīng)濟效益。Marla等[26]研究發(fā)現(xiàn)用含F(xiàn)AE酶活的奶酪飼喂老鼠，可以提高老鼠腸道中FAE酶活，降低血漿中硫代巴比妥酸反應物質(zhì)，提高谷胱甘肽還原酶活性，有助于提高動物的氧化應激性，防止氧化應激相關障礙。

3.3 FAE酶化發(fā)酵飼料對三元豬消化性能的影響

飼料轉(zhuǎn)化率越好，表明試驗動物對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收好。本試驗中，與基礎飼糧的高能量飼糧相比，發(fā)酵飼料和酶化發(fā)酵飼料的高纖維增強了畜禽腸道蠕動，縮短了飼料在胃腸中的保留時間，使得飼料轉(zhuǎn)化率低于基礎飼糧組。Strube等[27]提到提高飼料中纖維素含量和飼喂頻率，可以縮短飼料在豬腸胃中的保留時間。酶化發(fā)酵飼料組與發(fā)酵飼料組相比，干物質(zhì)的消化率有顯著提高，對粗蛋白質(zhì)、半纖維素的消化率有提高趨勢。這表明FAE酶化發(fā)酵飼料對三元豬干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和半纖維素消化、吸收起到了促進作用。

4 結 語

FAE與微生物飼料發(fā)酵劑共同發(fā)酵可以促進飼料中益生菌的生長，協(xié)同降解纖維素，增加飼料中FA、XOS等益生元質(zhì)量分數(shù)，提高飼料的營養(yǎng)價值。在三元豬飼料中添加酶化發(fā)酵飼料，可以顯著提高三元豬的平均日采食量和平均日增重，縮短飼喂周期，在一定程度上提高了飼料的消化率，增加三元豬養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。