焦 玲，謝 定，文 李，姜 博，陳 平，鄭瑞娜

（長沙理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，長沙 湖南410114）

乙酸乙酯又名醋酸乙酯，英文名Ethyl Acetate，具有水果香味，外觀為無色透明液體。乙酸乙酯是一種非常重要的有機(jī)化工原料，同時(shí)，還是釀酒行業(yè)常用的調(diào)香物質(zhì)，存在于所有的白酒之中[1，3]。目前在我國乙酸乙酯的生產(chǎn)基本上都是通過傳統(tǒng)方式在無機(jī)催化劑存在條件下化學(xué)合成，國際上也有少量從天然植物中分離提取方法來獲得[2]。而和化學(xué)合成法相比，酶法生物合成的乙酸乙酯不僅被認(rèn)為是高質(zhì)量的天然產(chǎn)品，而且具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、專一性好、易提取、易控制等優(yōu)點(diǎn)，被看成是很有希望工業(yè)化的新途徑[3]。稻米脂肪酶是一類具有高活性的可以催化多種物質(zhì)的生物催化劑，利用酵母展示技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)室在人工合成酵母菌壁蛋白 （GCW14）與稻米脂肪酶 （RL）組合基因（GCW14-RL）后，將其亞克隆到pPIC9k載體后轉(zhuǎn)化到GS115酵母菌中，成功構(gòu)建了pPIC9k-GCW14-Rlipase載體，并將RL展示在畢赤酵母GS115表面[4-5]，再將其進(jìn)行應(yīng)用。

本文作者將高密度發(fā)酵得到的畢赤酵母發(fā)酵液通過冷凍離心制得酵母全細(xì)胞[5]，再將其用于催化，確定了反應(yīng)最佳的稻米脂肪酶的酶活、底物摩爾比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和3A分子篩添加量等，以及采用不同來源的脂肪酶對(duì)催化合成乙酸乙酯的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

化學(xué)試劑：乙酸正戊酯（色譜純）：TCI（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；乙酸乙酯（色譜純）：天津市化學(xué)試劑研究所提供。正己烷（分析純）、無水乙醇（分析純）、乙酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；展示稻米脂肪酶的畢赤酵母全細(xì)胞催化劑為本實(shí)驗(yàn)室自制[4]。

儀器：GC-14C型氣相色譜儀（配氫火焰離子化檢測器（FID）、N2000色譜工作站）：日本島津公司產(chǎn)品；色譜柱 （SUPELCOWAX-10 30 m×0.32 mm×0.25 μm）：中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所提供；DT5-1型低速臺(tái)式離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司產(chǎn)品；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋：北京永光明醫(yī)療儀器廠制造。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 稻米脂肪酶酶活測定 采用對(duì)硝基苯酚法[6]。酶活力測定反應(yīng)體系總體積為10 mL，包括1 mL p-NPP底物溶液（50 mmol/L）以及8 mL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）及1 mL菌懸液；反應(yīng)體系混勻后在加熱振蕩器中35℃，800 r/min預(yù)熱5 min后，加入酶液進(jìn)行反應(yīng)，10 min后立即沸水浴加熱終止反應(yīng)，12 000 r/min離心終10 min取上清液在405 nm

式（1）中，X為脂肪酶活力，U/mL；c為脂肪酶濃度，μmol/mL；V 為脂肪酸溶液的體積，mL；V′為酶液的用量，mL；t為作用時(shí)間，min。

一個(gè)脂肪酶水解活力單位（U）定義為：在當(dāng)前反應(yīng)條件下，1分子酶每分鐘催化水解底物p-NPP生成 1 μmolp-NP所需的酶量。

1.2.2 乙酸乙酯的合成 稻米脂肪酶催化乙酸乙酯的酯合成反應(yīng)過程為，在150 mL的具塞三角瓶中，加入3.4 mL乙酸、2.9 mL無水乙醇和15 mL正己烷組成非水相酯化反應(yīng)體系，在30℃的溫度下預(yù)熱搖勻，30 min后加入酶活為6 300 U/g的稻米脂肪酶和1.2 g的3A分子篩以移走產(chǎn)物中的水分。在35℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)，定時(shí)取樣經(jīng)GC分析檢測并測定該酶催化酯化合成反應(yīng)體系中乙酸的轉(zhuǎn)化率。

1.2.3 反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的測定 將乙酸乙酯和底物測得的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的線性方程，算出在反應(yīng)體系中的各個(gè)物質(zhì)的摩爾濃度。處測定吸光度A405值。酶活力計(jì)算公式如下：

式（2）中，R為轉(zhuǎn)化率；M0為乙酸乙酯摩爾濃度；M1為生成的乙酸乙脂的摩爾濃度；M2為反應(yīng)后乙酸剩余的摩爾濃度。

1.2.4 GC色譜分析 N2000色譜工作站。采用程序升溫：起始柱溫55℃，恒溫1 min，以2℃/min升溫至80℃，恒溫2 min，再以20℃/min升溫至180℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度：200℃；采用氫焰離子化檢測器 （flame ionizationdetector，F(xiàn)ID）， 檢測器溫度：220 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流體積比：10∶1；進(jìn)樣量：1 μL；載氣：氫氣；流量：60 KPa；空氣流量：50 KPa。乙酸正戊酯為內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)法測定酯的含量，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 稻米脂肪酶的酶活對(duì)合成乙酸乙酯的影響

按1.2.2的方法構(gòu)成稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的反應(yīng)體系，當(dāng)反應(yīng)溫度為35℃、反應(yīng)時(shí)間為6 h，分別取酶活為 6 300、7 8750、10 500、15 750 U/g和31 500 U/g的稻米脂肪酶進(jìn)行酶促酯合成反應(yīng)，乙酸轉(zhuǎn)化率隨稻米脂肪酶的酶活的變化如圖1所示。

結(jié)果表明，稻米脂肪酶合成乙酸乙酯的反應(yīng)速度隨著酶活的增加而加快，當(dāng)?shù)久字久该富顝? 300 U/g增加到15 750 U/g時(shí)，反應(yīng)速率逐漸增大，乙酸轉(zhuǎn)化率從63.95%上升到87.94%，當(dāng)?shù)久字久该富钸_(dá)到15 750 U/g時(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到最大，當(dāng)?shù)久字久该富顝?5 750 U/g增加到31 500 U/g時(shí)，其反應(yīng)速率變化很小。若再增加稻米脂肪酶的酶活使得脂肪酶相對(duì)底物是過量的，而酶相對(duì)于底物過量時(shí)，所有的底物都已經(jīng)與脂肪酶活性中心結(jié)合，使得過量的酶對(duì)于反應(yīng)沒有貢獻(xiàn)，出于反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和工業(yè)化成本的考慮，因此，在所選底物濃度范圍內(nèi)，選擇稻米脂肪酶酶活為15 750 U/g最為合適。

2.2 酸醇摩爾比對(duì)合成乙酸乙酯的影響

由于乙酸和乙醇都是具有較強(qiáng)極性的有機(jī)化合物，通過控制乙酸和乙醇在反應(yīng)體系中的摩爾比，不僅可以改變反應(yīng)速率，縮短反應(yīng)所需時(shí)間，還可以有效的促進(jìn)反應(yīng)向生成乙酸乙酯的方向進(jìn)行。因此，本作者通過對(duì)幾種不同的酸醇摩爾比進(jìn)行比較，以確定反應(yīng)最佳的酸醇摩爾比。在15 mL正己烷中固定加入2.9 mL乙醇、酶活為15 750 U/g稻米脂肪酶、1.2 g 3A分子篩，通過改變反應(yīng)體系中的乙酸量來調(diào)節(jié)酸醇的摩爾比，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酸醇摩爾比對(duì)合成乙酸乙酯的影響Fig.2 Effect of the molar ratio of acetic acid toethanol on the synthesis of ethyl acetate

對(duì)比這5組實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在酸醇摩爾比為1.2∶1.0時(shí)，其乙酸轉(zhuǎn)化率達(dá)最大值，其轉(zhuǎn)化率高達(dá)89.43%，在酸醇摩爾比為1.4∶1.0時(shí)的乙酸轉(zhuǎn)化率在5組實(shí)驗(yàn)中是最慢的，這表明乙酸的濃度過高，對(duì)脂肪酶的合成活性產(chǎn)生了負(fù)面影響，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率偏低。 在酸醇摩爾比為 1∶1、1∶1.2、1∶1.4 這 3 組實(shí)驗(yàn)中，乙酸轉(zhuǎn)化率與之相比逐漸的下降，這是因?yàn)榉磻?yīng)體系中底物濃度過低，降低了酶與底物接觸并催化其發(fā)生反應(yīng)的概率，從而無法充分發(fā)揮其催化活性。因此，選取1.2∶1的酸醇摩爾比定為最適稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的實(shí)驗(yàn)條件。

2.3 溫度對(duì)合成乙酸乙酯的影響

按1.2.2的方法構(gòu)成稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的反應(yīng)體系，每瓶加入稻米脂肪酶的酶活量為15 750 U/g、3A分子篩1.2 g，當(dāng)反應(yīng)溫度分別為25、30、35、40 ℃和 45 ℃時(shí)，乙酸轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的變化如圖3所示。

圖3 溫度對(duì)合成乙酸乙酯的影響Fig.3 Effect of temparature on the synthesis of ethyl acetate

結(jié)果表明，溫度對(duì)稻米脂肪酶催化反應(yīng)速度有很大的影響。隨著反應(yīng)溫度的升高，乙酸轉(zhuǎn)化率有所提高，當(dāng)反應(yīng)溫度為40℃時(shí)，乙酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，然而當(dāng)溫度提高到45℃時(shí)，乙酸轉(zhuǎn)化率有明顯下降。這是因?yàn)楦邷乜梢蕴岣叻磻?yīng)初速度，因此在反應(yīng)初始階段溫度越高，乙酸的轉(zhuǎn)化率越高，然而提高溫度同樣也會(huì)加快酶失活，使得反應(yīng)速率迅速下降。因此，從降低能量消耗的角度考慮，選取40℃作為最優(yōu)反應(yīng)溫度。

2.4 反應(yīng)時(shí)間的影響

按1.2.2的方法構(gòu)成稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的反應(yīng)體系，每瓶加入稻米脂肪酶的酶活量為15 750 U/g、3A分子篩1.2 g，當(dāng)脂肪酶反應(yīng)溫度為40℃時(shí)，反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙酸轉(zhuǎn)化率的影響如圖4所示。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成乙酸乙酯的影響Fig.4 Effect of time on the synthesis of ethyl acetate

從圖4看出，在加入稻米脂肪酶后0～4 h內(nèi)，乙酸轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化呈直線上升，隨著時(shí)間的推移，上升趨勢漸緩，當(dāng)?shù)竭_(dá)4 h以后，乙酸轉(zhuǎn)化率已基本穩(wěn)定。由于反應(yīng)產(chǎn)物的累加，一般情況下，反應(yīng)時(shí)間越長，產(chǎn)物越多。但考慮到時(shí)間成本，經(jīng)濟(jì)成本，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行4 h后，乙酸轉(zhuǎn)化率已達(dá)到89.93%，與最終趨于穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化率相差不大。因此，選取反應(yīng)時(shí)間為4 h較為合適。

2.5 3A分子篩添加質(zhì)量的影響

按1.2.2的方法構(gòu)成稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的反應(yīng)體系，在反應(yīng)溫度為35℃、稻米脂肪酶的酶活為15 750 U/g時(shí)，3A分子篩對(duì)乙酸轉(zhuǎn)化率的影響如圖5所示。

圖5 3A分子篩的添加質(zhì)量對(duì)合成乙酸乙酯的影響Fig.5 Effect of 3A molecular sieve on the synthesis of ethyl acetate

從上圖可以看出，在分別加入3A分子篩0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 g 時(shí)，乙酸轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)出升高趨勢，乙酸乙酯的純度有所提高，當(dāng)分子篩添加質(zhì)量達(dá)到1.2 g（相當(dāng)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的添加量）時(shí)乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率達(dá)最大值，這是因?yàn)?A分子篩能夠吸附反應(yīng)體系中的一部分水分，使得反應(yīng)能夠向生成乙酸乙酯的方向進(jìn)行，當(dāng)繼續(xù)向反應(yīng)體系加入分子篩時(shí)，由于反應(yīng)體系中的水已被分子篩吸取使反應(yīng)趨向生成乙酸乙酯的方向達(dá)到平衡，此時(shí)的乙酸乙酯含量已經(jīng)達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值。因此，選取1.2 g（相當(dāng)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的添加量）分子篩為最合適的分子篩添加質(zhì)量。

2.6 不同脂肪酶對(duì)合成乙酸乙酯的影響

按1.2.2的方法構(gòu)成稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的反應(yīng)體系，分別測定稻米脂肪酶、國產(chǎn)堿性脂肪酶和標(biāo)準(zhǔn)脂肪酶3種脂肪酶在正己烷體系中的乙酸轉(zhuǎn)化率，考察3種不同來源的脂肪酶對(duì)合成乙酸乙酯的影響。不同脂肪酶對(duì)乙酸轉(zhuǎn)化率的影響如圖6所示。

圖6 不同脂肪酸對(duì)合成乙酸乙酯的影響Fig.6 Effect of different lipase on the synthesis of ethyl acetate

上圖可知，在堿性脂肪酶、標(biāo)準(zhǔn)脂肪酶和稻米脂肪酶3種酶中，就乙酸轉(zhuǎn)化率而言，堿性脂肪酶的效率最低，稻米脂肪酶比標(biāo)準(zhǔn)脂肪酶的催化合成效率略高。

3 結(jié) 語

通過研究發(fā)現(xiàn)，在有機(jī)溶劑中決定酯合成反應(yīng)的關(guān)鍵還是脂肪酶的選擇。不同來源的脂肪酶，由于其底物特異性的差異導(dǎo)致其合成酯的能力也不一樣。即使是同種脂肪酶，根據(jù)其活力的大小也會(huì)對(duì)目的產(chǎn)物的合成造成影響。根據(jù)工業(yè)化生產(chǎn)的需要，選擇一種適合目的產(chǎn)物高效合成的脂肪酶至關(guān)重要。在有機(jī)溶劑正己烷中，畢赤酵母細(xì)胞表面的稻米脂肪酶作為催化劑催化乙酸和乙醇合成乙酸乙酯的轉(zhuǎn)化率高，是一種適合工業(yè)化生產(chǎn)的途徑。通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定了稻米脂肪酶添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、底物摩爾比、3A分子篩的添加質(zhì)量等一系列影響稻米脂肪酶合成乙酸乙酯的因素，確定了反應(yīng)最優(yōu)工藝條件：在15 mL正己烷中，稻米脂肪酶的酶活為15 750 U/g，3A分子篩的添加質(zhì)量為1.2 g（相當(dāng)于8 g/mL的添加質(zhì)量濃度），底物摩爾比（乙酸∶乙醇）為1.2∶1，在 40℃條件下振蕩反應(yīng)4 h，合成乙酸乙酯的的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到90.92%。在測定稻米脂肪酶催化反應(yīng)體系中乙酸乙酯濃度時(shí)利用毛細(xì)管氣相色譜法可更有效、快速、準(zhǔn)確地研究酶法合成乙酸乙酯的相關(guān)課題，也可在該法的工業(yè)化生產(chǎn)中，為乙酸乙酯質(zhì)量分析提供借鑒。