王 祎 陳婷婷 倪 普 朱一鳴 黃 華 馮宜飛 馮奕鵬 尚立芝張紅瑞

（河南中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，河南 鄭州 450046）

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種可以預防和治療的常見疾病，其特征是持續(xù)存在的、并呈進行性發(fā)展氣流受限[1]。COPD的發(fā)病機制尚未完全明了，目前普遍認為COPD是以氣道、肺實質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為特征，由多種炎癥細胞及炎癥介質(zhì)參與且相互作用所致，中性粒細胞活化、聚集、釋放彈性蛋白酶等多種生物活性物質(zhì)引起慢性黏液高分泌狀態(tài)并破壞肺實質(zhì)。COPD的主要臨床表現(xiàn)為慢性咳嗽，咳痰，呼吸困難，常出現(xiàn)急性加重，多屬于中醫(yī)學“肺脹”“喘病”等范疇[2]。中醫(yī)認為，COPD多表現(xiàn)為肺、脾、腎三臟的虛損，而痰濁和瘀血在其發(fā)病過程中扮演了病理產(chǎn)物和致病因素雙重角色，互結為病，惡性循環(huán)，遷延難愈[3]。故而COPD的基本治法為化痰祛瘀，調(diào)暢氣機。愛羅咳喘寧中藥方劑有理氣化痰，止咳平喘，健脾固腎之效，經(jīng)多年臨床和前期動物實驗研究結果顯示，愛羅咳喘寧口服液能顯著提高COPD患者和動物模型的肺功能，改善肺組織結構，但其作用機制不明[4]。白細胞介素4（IL-4）是由活化的Th2（Th2型反應，即體液免疫）細胞產(chǎn)生的一種細胞因子，而白細胞介素12（IL-12）是由活化的Th1（Th1型反應，即細胞免疫）細胞產(chǎn)生的細胞因子[5]。在COPD患者體內(nèi)，Th2淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子降低，而Th1淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子升高[6-7]。同時，有研究顯示肺組織炎癥反應越嚴重，血清IFN-gamma、IL-12、Th1/Th2， 及肺組織中IFN-gamma的 mRNA與STAT4蛋白水平越高，而肺功能及血清IL-4、IL-13及肺組織中IL-4 mRNA水平越低[8]。因此，白細胞介素4（IL-4） 和白細胞介素12（IL-12）的分子學檢驗對于分析COPD患者的病程與轉(zhuǎn)歸有重要意義。干擾素-γ（INF-γ）是一種多功能的細胞因子，臨床研究表明，INF-γ具有抑制腫瘤生成、抗病毒、調(diào)節(jié)機體免疫力等作用[9]。處于急性加重期的COPD患者易在活化巨噬細胞作用下加快白細胞介素-12(IL-12） 的釋放速度，增加血液內(nèi)IL-12濃度，進一步刺激巨噬細胞及T細胞，提高血液內(nèi)INF-γ水平，加重肺部組織損傷嚴重，影響患者預后質(zhì)量[10]。INF-γ直接參與COPD的發(fā)病過程，與患者病情發(fā)展程度呈正相關性，臨床應用價值較高[11-12]。本研究通過觀察愛羅咳喘寧對COPD大鼠支氣管肺泡灌洗液及肺組織勻漿中參與炎癥反應的白細胞介素-4（IL-4），白細胞介素-12（IL-12），干擾素-γ（INF-γ） 的影響，以期研究愛羅咳喘寧的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 7～8周齡SPF級wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量（250±20） g。由河南省實驗動物中心提供，合格證號SYXY（豫） 2010-0001。

1.1.2 藥物 陳皮10 g(批號1502001H），茯苓15 g(批號1509001H），姜半夏10 g(批號1503001s），甘草6 g(批號1502001S）均選三九醫(yī)藥生產(chǎn)的中藥配方顆粒，紅旗渠香煙 (河南安陽廠，烤煙型，尼古丁含量1.1 mg/支，焦油含量14 mg/支），急支糖漿（太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司，規(guī)格100 mL/瓶，批號15090660）。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠IL-4酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 (杭州聯(lián)科生物有限公司，批號230440715）、IL-12（北京誠林生物科技有限公司，批號201504）、INF-γ(上海邦奕公司，DRE20041）ELISA檢測試劑盒。紅旗渠牌香煙（河南安陽卷煙廠，烤煙型，尼古丁含量1.1 mg/支，焦油含量14 mg/支），脂多糖 (LPS，北京索萊寶科技有限公司，批號701C036）。小動物肺功能測量系統(tǒng)（德國leica公司）。BS210生物顯微鏡（麥克奧迪廈門銷售有限公司），BSA124S-CW型萬分之一天平 (德國賽多利斯），半自動輪轉(zhuǎn)式切片機 (德國leica公司，RM2245），DB-B1型烤片機 (上海雙旭電子有限公司），XH-C旋渦混合器 (常州金壇精達儀器有限公司），B11-3型磁力攪拌器 (上海司爾儀器有限公司），DHP-9050B智能型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海浪軒實驗設備有限公司），ZWY-240型恒溫搖床 (上海智誠），BCD-206YH型海爾冰箱(青島海爾股份有限公司）等由河南中醫(yī)學院科研試驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將60只大鼠隨機分為6組：正常對照組，模型組，愛羅咳喘寧低、中、高劑量組和急支糖漿組，每組10只。

1.2.2 模型制備 采用香煙煙熏4周加氣管內(nèi)滴注脂多糖（LPS）2次的復合因素復制COPD穩(wěn)定期肺氣虛證大鼠模型。實驗第1、14日，麻醉，暴露氣管，1 mL注射器預裝200μL的LPS注入氣管內(nèi)，立即豎起大鼠旋轉(zhuǎn)，以防窒息并使LPS均勻分布于兩肺。實驗第2～13日、15～28日將大鼠置于密閉煙室（側(cè)面開直徑0.5 cm2通氣孔），50 mL針筒抽取紅旗渠香煙煙霧注入密閉熏煙箱內(nèi)，保持煙霧濃度為5%，每日0.5 h。正常對照組不予煙熏，但采用LPS注入相同的方法氣管內(nèi)注入等量的生理鹽水代替LPS。

1.2.3 給藥方案 愛羅咳喘寧組中劑量組按正常劑量生藥量4.9 g/kg（稀釋成6 mL）灌胃，高劑量組按9.8 g/kg（稀釋成6 mL）灌胃，低劑量組2.45 g/kg（稀釋成6 mL）灌胃，每天2次，10AM與4PM各給藥1次。急支糖漿組給予急支糖漿口服液每天3 mL（稀釋成6 mL），分2次灌胃（按中劑量組成人用量7倍折算）；空白對照組及模型組給予同等劑量（6 mL）的生理鹽水灌胃。以上各組連續(xù)灌胃14 d。

1.2.4 檢測指標 （1）大鼠的一般狀態(tài)：包括皮毛、體重、飲食情況、活動度、死亡情況；（2） 肺功能測定：潮氣量（Tidal volume，TV）、呼氣峰流速（Peak expiratory flow，PEF） 和50%潮氣量呼氣流量（Expiratory flow at 50%of lung volume，EF50）； （3） 血常規(guī)檢查；（4）ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液及肺勻漿中INF-γ、IL-4、IL-12的含量；（5） 病理切片觀察 （固定，脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。連續(xù)冠狀切片，HE染色，光鏡下觀察病理變化）；（6）免疫組化檢測肺組織中INF-γ的表達（①切片脫蠟至水；②過氧化物酶阻斷；③抗原熱修復；④滴加封閉液；⑤滴加一抗，4℃過夜；⑥滴加山羊抗兔IgG；⑧滴加試劑SABC；⑨DAB顯色，蘇木素復染）。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件統(tǒng)計分析，定量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）描述，組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，相關性檢驗用Spearman等級相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 愛羅咳喘寧對大鼠一般狀況的影響 正常組大鼠無死亡，精神狀況佳，活動靈敏，毛色乳白有光澤，大、小便無異常。造模初期，第1～14天時，造模的大鼠出現(xiàn)不同程度的抵抗及煩躁，第15天后神情倦怠，體型消瘦，毛色略黃無光澤，體重下降，飲食量及飲水量減少，大便稀而致墊料潮濕，可聞及呼吸音增粗、呼吸頻率增快、咳嗽、氣喘、鼻部可見淺黃色分泌物等。灌胃后，治療組的以上癥狀呈不同程度的改善，其中愛羅咳喘寧中劑量組的癥狀改善最為明顯。其他各組均死亡2只大鼠。

2.2 各組肺功能比較 與正常組比較，模型組大鼠用力肺活量（Forced vital capacity，F(xiàn)VC）、1秒鐘用力呼吸容積（Forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1），以及FEV1/FVC均顯著變小（P<0.05）；與模型組比較，愛羅咳喘寧高、中劑量組FVC、FEV1，F(xiàn)EV1/FVC均不同程度增大（P<0.05），見表1。

表1 愛羅咳喘寧對各組大鼠肺功能的影響 （x±s）

2.3 愛羅咳喘寧對肺勻漿中INF-γ、IL-4和IL-12含量的影響 模型組肺勻漿中INF-γ、IL-4和IL-12含量均顯著高于正常組（P<0.01，P<0.05）。

與模型組比較愛羅咳喘寧中、高劑量組中INF-γ、IL-4和IL-12均顯著減少 （P<0.01，P<0.05）。

免疫組化檢測肺組織中INF-γ表達，模型組INF-γ表達顯著強于正常組。愛羅咳喘寧中、高劑量組中INF-γ表達較模型組減弱。見表2。

表2 愛羅咳喘寧對肺勻漿中INF-γ，IL-4和IL-12含量及INF-γ表達的影響 （x±s）

2.4 愛羅咳喘寧對肺組織結構的影響 正常組肺組織結構完整，肺泡腔內(nèi)無滲出物。模型組肺內(nèi)細支氣管內(nèi)有痰，肺泡上皮細胞不同程度的損傷，肺泡中有滲出液及炎細胞，肺泡間質(zhì)炎細胞浸潤明顯，局部有肺大泡（肺氣腫形成）。愛羅咳喘寧中、高劑量組和急支糖漿組炎癥明顯減輕。見圖1。

2.5 免疫組化檢測肺組織中INF-γ的表達 與正常組比較，模型組INF-γ表達明顯增強，INF-γ陽性表達信號定位于肺泡上皮細胞胞漿和巨噬細胞胞漿。與模型組比較，愛羅咳喘寧中、高劑量組INF-γ表達顯著增強。各組表達強度見表2，圖2。

圖1 各組肺組織結構改變（HE，×200）

3 討論

本研究結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠FVC、FEV1，以及FEV1/FVC均顯著變?。慌c模型組比較，愛羅咳喘寧高、中劑量組FVC、FEV1，F(xiàn)EV1/FVC均不同程度增大，提示愛羅咳喘寧能改善COPD大鼠肺功能?；诖耍撗芯靠紤]可以用炎癥細胞因子及其受體蛋白等生物指標來反映COPD患者的臨床肺功能。血清IL-6、TNF-α、INF-γ等炎癥介質(zhì)的表達水平均同COPD合并肺部感染呈顯著相關性，臨床可將其作為評估患者病情發(fā)展、預測其預后質(zhì)量的重要依據(jù)，全面提升診療針對性及有效性。模型組肺勻漿中INF-γ、IL-4和IL-12含量均顯著高于正常組。通過各組對肺勻漿中INF-γ、IL-4和IL-12含量的比較，與模型組比較，愛羅咳喘寧中、高劑量組中INF-γ、IL-4和IL-12均顯著減少。免疫組化檢測肺組織中INF-γ表達，模型組INF-γ表達顯著強于正常組。愛羅咳喘寧中、高劑量組中INF-γ表達較模型組減弱。肺組織結構光鏡下顯示，正常組肺組織結構完整，肺泡腔內(nèi)無滲出物。模型組肺內(nèi)細支氣管內(nèi)有痰，肺泡上皮細胞不同程度的損傷，肺泡中有滲出液及炎細胞，肺泡間質(zhì)炎細胞浸潤明顯，局部有肺大泡（肺氣腫形成）。愛羅咳喘寧中、高劑量組和急支糖漿組炎癥明顯減輕。免疫組化檢測肺組織中INF-γ的表達，與正常組比較，模型組INF-γ表達明顯增強，INF-γ陽性表達信號定位于肺泡上皮細胞胞漿和巨噬細胞胞漿。與模型組比較，愛羅咳喘寧中、高劑量組INF-γ表達顯著減弱，提示愛羅咳喘寧可能通過抑制INF-γ的表達而對抗炎癥反應。

綜上所述，與正常組相比，模型組中INF-γ，IL-4和IL-12含量高于正常組，提示INF-γ，IL-4和IL-12均參與COPD病理過程。愛羅咳喘寧對COPD干預有效，其機制可能通過抑制INF-γ，IL-4和IL-12的合成與分泌而阻滯COPD炎癥過程。其詳細機制有待深入研究。