徐馬俊坤， 馮 博， 張昭寰， 孫曉紅,2,3， 潘迎捷,2,3， 趙 勇,2,3*

(1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心， 上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部 水產(chǎn)品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海 201306)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種嗜鹽性革蘭陰性弧菌，廣泛分布于河海交界處、海水及沿海地區(qū)，是我國沿海地區(qū)引起食物中毒的重要致病菌[1-3]。隨著海產(chǎn)品消費水平的不斷提高，在日本、北美、東南亞等地微生物引起的食源性疾病爆發(fā)事件中，副溶血性弧菌污染也成為首要因素[4-7]。副溶血性弧菌經(jīng)污染的食物進入消化道后，附著于腸道細胞，在腸道繁殖并分泌出各種分泌物，易引起急性胃腸炎和原發(fā)性敗血癥等疾病[8-9]。其中溶血毒素是副溶血性弧菌的主要致病因子，包括分別由毒力基因tdh和trh編碼產(chǎn)生的耐熱直接溶血毒素(thermostable direct hemolysin，TDH)和相對耐熱直接溶血毒素(TDH-related hemolysin，TRH)[10-11]。副溶血性弧菌在水產(chǎn)品中雖然有很高的檢出率，但其中致病性菌株比例較低。傳統(tǒng)的副溶血性弧菌檢測方法費時費力,且難以區(qū)分致病性菌株，給定量風險評估帶來了很大障礙。隨著分子生物學技術的發(fā)展，分子生物學方法已經(jīng)成為現(xiàn)代微生物學的重要手段。其中原位雜交(insituthybridization)技術的原理是dsDNA變性后與帶有互補序列的同源單鏈配對，退火復性后形成雙鏈結構的DNA或DNA/RNA異質雙鏈分子。帶有標記的探針與固定在玻片或纖維膜上的組織或細胞中特定的核苷酸序列進行雜交，可以探測其中所有的同源核酸序列，無需單獨提取DNA或RNA。該技術靈敏度高，特異性好[12]，可根據(jù)探針的選擇提供微生物數(shù)量和致病性等多種信息。原位雜交方法一方面可以為致病菌株的篩選提供便利，大大提高菌種篩選的針對性；另一方面其本身也是一種高效的檢測方法。但在菌落的原位雜交中存在著雜交背景復雜及雜交結果不穩(wěn)定的問題，目前尚鮮有報道用于副溶血性弧菌的檢測，因此，進一步優(yōu)化雜交體系顯得尤為迫切。本研究重點探討致病性副溶血性弧菌檢測中菌落雜交技術的應用，并優(yōu)化菌落雜交技術用于致病性副溶血性弧菌檢測的最佳條件，從而使水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的風險評估更快、更準確、更簡便。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)標準菌株ATCC17802(tdh-/trh+)、ATCC33846(tdh+/trh-)、ATCC33847(tdh+/trh-)及由本實驗室自海產(chǎn)品中分離獲得的副溶血性弧菌野生菌株VP24(tdh-/trh-)，所有菌株的毒力基因均經(jīng)過tPCR方法鑒定。單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)菌株WaX12 為上海市市場購買的生豬肉中分離得到的野生致病菌。

1.1.2 試劑 地高辛檢測試劑盒(瑞士Roche公司)，尼龍膜(美國Sigma公司)，胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽蔗糖瓊脂(TCBS瓊脂)，腦心浸液肉湯(BHI)均購自北京陸橋技術有限責任公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 HL-2000組合型分子雜交箱(美國UVP公司)，Bio-Tek 酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)，5810R離心機(美國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備 將副溶血性弧菌劃線接種于TCBS 平板，挑取單菌落于5 mL TSB的試管中，37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)10 h，連續(xù)活化2 次，作為接種液，備用。單增李斯特菌接種至BHI 液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)10 h，按 1∶ 100比例接種于5 mL BHI 液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)備用。

1.2.2 探針的合成 本研究所用的寡核苷酸探針為p-tdh、p-trh及p-toxR，根據(jù)文獻報道合成[13]。p-tdh用于檢測毒力基因tdh，探針序列為5′-CAACTTTTAATACCCAAGCTCCGGTCAATGTA-AAGG-3′；p-trh用于檢測毒力基因trh，探針序列為5′AGGCTCAAAATGGTTAAGCGCCTATATGAC-GGTAAA-3′；p-toxR用于檢測副溶血性弧菌標志基因toxR，探針序列為5′-ATTACTACCGATTTGC-GTACTGCTGTTTACAAACCC-3′。所有的DNA探針委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并采用地高辛5′端標記，保存濃度為25 ng/μL。

1.2.3 斑點雜交 斑點雜交是通過在雜交膜上點加樣品DNA代替菌落的原位雜交檢測方法。通過斑點雜交方法對探針性能進行驗證，并在基礎流程基礎上確定一套較為快速簡便的雜交條件下限用于后續(xù)優(yōu)化的參考。取副溶血性弧菌接種液100 μL接種到9 mL TSB中，單增李斯特菌接種液100 μL接種到9 mL BHI中，37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)10 h，通過DNA提取試劑盒提取DNA。通過將ATCC33847的DNA以150 μg/mL 2 μL，100 μg/mL 2、5、10 μL， 50 μg/mL 2、5、10、15 μL的不同點樣量滴加到雜交膜上，于80 ℃熱固定2 h，按試劑盒所建議方法雜交顯色，確定合適的DNA點樣量，以用于后續(xù)優(yōu)化實驗。將菌株ATCC17802、ATCC33846、ATCC33847、VP24的DNA模板分別點到雜交膜上，并以單增李斯特菌DNA作為對照，進行同樣的斑點雜交顯色驗證探針的特異性實驗，每組實驗重復2次。

1.2.4 菌落雜交 菌落雜交的主要步驟為印跡、裂解、固定、預雜交、雜交、顯色。本研究參考DIG Application Manual for Filter Hybridization (DIG-AMFH， Roche Diagnostics，2008)的方法，結合 Roche公司 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ試劑盒進行雜交實驗。①前處理過程的優(yōu)化：a.涂布平板：取副溶血性弧菌接種液進行10×梯度稀釋后，滴加到添加了3% NaCl的TSA培養(yǎng)基上涂布平板，37 ℃培養(yǎng)10～16 h，每1 h對菌落進行觀察并取樣篩選用于影印，比較影印結果。b.菌落轉移：尼龍膜剪成比培養(yǎng)皿略小的圓形，在膜上斜剪一刀作為標記，以確定膜的正反面和菌落位置。將雜交膜分別覆蓋平板20、40和60 s，比較影印結果。 c.菌落裂解：堿裂解法：反復從膜反面滲透0.5 mol/L的NaOH溶液裂解并通過Tris·Cl(pH 7.4)平衡后晾干；溶菌酶處理：將膜浸入含有溶菌酶(2 mg/mL)溶液中，37 ℃作用30 min。單獨使用兩種不同處理方法，雜交并比較顯色結果。d.DNA的固定：通過紫外交聯(lián)2 min后晾干備用；80 ℃熱固定2 h后備用。單獨使用兩種不同處理方法，雜交并比較顯色結果。e.洗膜：2×SSC 0.5% SDS溶液漂洗雜交膜2次，需要充分浸潤并輕輕振蕩，每次5 min。0.5×SSC 0.5% SDS溶液漂洗雜交膜2次，每次5 min。②雜交顯色過程的優(yōu)化:a.預雜交：嚴謹洗滌雜交膜去除菌落碎片和未固定的DNA后，將每張雜交膜分裝到不同容器，加入5 mL以上預熱的雜交緩沖液，進行37 ℃ 30 min的預雜交。b.雜交：倒出預雜交液，向每張雜交膜上加入3.5 mL預熱的雜交液(探針濃度25 ng/mL)，37 ℃振蕩孵育，分別測試4、6、8、10、12 h的雜交時間，比較顯色結果。c.顯色：對雜交膜進行一次嚴謹洗滌去除未結合的探針后，按照地高辛雜交檢測試劑盒 I 的說明進行信號檢測。洗滌緩沖液中Tween-20濃度調(diào)整為0.2%、0.3%、0.4%(體積分數(shù))，封閉和抗體結合時間分別延長0.5 h，比較顯色結果。對比顯色結果，4 h起每隔1 h進行觀察，或8 h第一次觀察后，每隔1 h進行觀察。所有比較顯色結果的優(yōu)化實驗重復2次。

2 結果與分析

2.1 斑點雜交對探針的鑒定

根據(jù)Suffredini等[13]的報道，本研究所使用的3個寡核苷酸探針特異性、靈敏度較好，性能基本相同。通過斑點雜交進行了驗證實驗，如圖1所示，結果證明本實驗所用菌株DNA均能被對應探針正確檢出或排除。圖2為通過tdh探針檢測不同濃度ATCC33847菌株DNA的斑點雜交結果。從圖 2 可看出，在斑點雜交中，DNA濃度對顯色結果有較大影響，且低濃度時有結果不穩(wěn)定的風險，但在同樣的DNA濃度下，由于尼龍膜的毛細作用，在將DNA 點樣量提高到10 μL以上后不能再提高顯色結果，同時提取100 μg/mL以上濃度的DNA通常需要增加額外的操作和檢測。因此斑點雜交實驗確定的點樣量為100 μg/mL 10 μL，用于后續(xù)的優(yōu)化實驗。

通過斑點雜交的預實驗顯示，對于DNA樣品的檢測，紫外交聯(lián)2 min固定，37 ℃預雜交30 min、雜交4 h、顯色8 h的雜交方法可以獲得較為正常的顯色結果。

2.2 菌落原位雜交前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 細菌培養(yǎng)和影印 根據(jù)比較影印后平板和膜上菌落，選擇了37 ℃ 14 h的細菌培養(yǎng)時間，細菌培養(yǎng)時間過短，平板上菌落過小，影印后容易出現(xiàn)損失，對應性差不利于后續(xù)使用；培養(yǎng)時間過長菌落過大甚至出現(xiàn)自溶，影響后續(xù)雜交顯色。

2.2.2 菌體裂解 在菌落雜交中對溶菌酶處理和堿法裂解進行了比較，結果顯色差異不明顯，但溶菌酶需要浸泡處理，且也存在一定不穩(wěn)定性，根據(jù)菌落本身的生長狀態(tài)和影印的質量不同，易造成極為復雜的背景甚至實驗失敗，圖3為不同前處理方式的菌落顯色后的結果。在菌體的裂解過程中，溶菌酶主要通過破壞細胞壁使內(nèi)容物逸出而使細菌溶解。而副溶血性弧菌是一種細胞壁較薄的革蘭陰性菌，堿裂解法可以完全替代溶菌酶處理，同時堿裂解法從反面滲透，保持了菌體DNA不會隨液體逸散，也增強了實驗結果的穩(wěn)定性。

圖1 3種寡核苷酸探針用于斑點雜交檢測副溶血性弧菌及單增李斯特菌DNA的結果Fig.1 The results of Vibrio parahaemolyticus and Listeria monocytogenes DNA detected by dot blot hybridization using 3 oligoprobes1、2：菌株ATCC33846；3、4：菌株ATCC33847；5、6：菌株ATCC17802；7、8：菌株VP24；9：菌株Wax12；A：p-tdh檢測結果；B：p-trh檢測結果；C：p-toxR檢測結果1, 2: ATCC33846; 3, 4: ATCC33847; 5, 6: ATCC33802; 7, 8: VP24；9: Wax12； A：detected by p-tdh; B：detected by p-trh; C：detected by p-toxR

圖2 不同DNA點樣量的斑點雜交顯色結果對比Fig.2 Comparison of different sampling amount in dot blot hybridization

2.2.3 固定方法 通過斑點雜交比較了紫外交聯(lián)2 min和熱固定2 h的固定方法，其結果顯色和背景均無明顯差異，但是紫外交聯(lián)法在菌落原位雜交實驗中存在實驗結果不穩(wěn)定的現(xiàn)象，給實驗增加了一定的不確定性，可能是由于表面沒有充分干燥或菌落較厚，水膜或是菌體本身阻擋了紫外線的穿透，造成菌體與膜的接觸位置并未實際獲得紫外交聯(lián)的效果。同時紫外交聯(lián)的功率需要專用的器材保障是檢測方法推廣中的一項障礙。而考慮到紫外交聯(lián)本身所需時間較短，在實際實驗中，也可以考慮紫外與熱固定聯(lián)用的方法。

圖3為前處理過程優(yōu)化前可能出現(xiàn)的結果和優(yōu)化后的顯色結果，根據(jù)優(yōu)化結果，本實驗后續(xù)的菌落原位雜交選擇采用37 ℃培養(yǎng)14 h后影印、堿法裂解、80 ℃熱固定2 h的前處理方法。

圖3 不同前處理方法獲得的菌落原位雜交顯色結果對比Fig.3 Comparison of different pretreatment methods in colony in situ hybridizationA：培養(yǎng)時間過長的菌落影印后的顯色結果；B：溶菌酶處理菌體的顯色結果；C：優(yōu)化方法后的顯色結果A: the result of long-time culture colonies；B: the result of lysozyme method C: the result of optimization

2.3 菌落原位雜交過程的優(yōu)化

2.3.1 雜交時間 由于寡核苷酸探針長度較短，探針本身對溫度的要求差異較小，因此雜交過程主要針對雜交時間進行摸索。在實際雜交過程中由于雜交效率隨時間的增長存在收益遞減的現(xiàn)象，在斑點雜交實驗中大部分雜交過程實際在前4 h已基本完成。但在菌落原位雜交實際操作的比較中，37 ℃雜交4～6 h的雜交結果仍存在顯色不明顯的現(xiàn)象和結果不穩(wěn)定的風險，而8～10 h的過夜雜交則可以明顯增強實驗的穩(wěn)定性和改善顯色的結果。而8 h后的雜交幾乎已經(jīng)沒有收益，但在14 h內(nèi)并未觀察到延長時間對顯色造成負面影響?？赡苁怯捎诨A流程的洗脫過程已較為完善，探針很難在雜交膜空白處產(chǎn)生殘留。

2.3.2 免疫檢測 在標準流程所獲結果不穩(wěn)定，背景復雜的基礎上，主要針對去除背景、增強穩(wěn)定性對免疫檢測和顯色過程進行了一系列調(diào)整，將封閉時間和抗體結合時間分別延長0.5 h后，信號強度和穩(wěn)定性有所提高，且沒有觀察到造成背景的增強。顯色階段洗滌緩沖液Tween-20在3個添加濃度下，總體差異不大，增加洗滌液中Tween20的濃度并未明顯改善背景。相比更高濃度，添加0.2%體積Tween20的洗滌液所得到的結果相比更加清晰穩(wěn)定。

2.3.3 顯色時間 確定了顯色液浸泡8 h的顯色時間，8 h內(nèi)避光反應顯色點與背景的色差不斷增強，提前觀察有破壞避光環(huán)境的風險，8 h顯色后停止反應并洗滌后雜交膜的背景仍保持接近白色，而繼續(xù)反應會連同背景一同加深，肉眼觀察色差并無明顯變化。因此，本研究的菌落原位雜交選擇采用37 ℃預雜交30 min后雜交8 h，封閉1 h，抗體結合1 h，2%(體積分數(shù))Tween-20洗脫液洗脫后顯色8 h的雜交過程。

3 討 論

對于生物素標記探針的原位雜交方法，國內(nèi)外學者已經(jīng)進行了多方面的研究，劉超蘭等[14]設計并優(yōu)化了一套可用于釀酒微生物菌種篩選的菌落原位雜交方法，呂欣等[15]利用DGGE-菌落原位雜交方法針對性地分離土壤中地精喹禾靈降解菌，楊穎等[16]建立了大腸桿菌Nissle 1917的原位雜交鑒定方法。Saidi等[17]通過PCR結合菌落原位雜交的方法協(xié)助確認了霍亂弧菌菌株的基因型。

目前原位雜交技術多種多樣，但在對環(huán)境中的微生物進行檢測時，菌落原位雜交仍然是最常用的方法之一[18]。而針對食源性致病菌尤其是副溶血性弧菌的研究報道仍然較少，一些學者提出了原位雜交在弧菌檢測方面的應用，Givens等[19]通過菌落原位雜交與qPCR共同定量檢測了春冬季節(jié)魚、牡蠣、水體和沉積物中副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌。而本研究認為該技術在種內(nèi)致病株檢測方面也有獨特的優(yōu)勢，同時也有助于菌株的分離和篩選。

在原位雜交實驗中，要保證低背景、著色清晰、穩(wěn)定性好的實驗結果，不僅需要嚴格操作選擇合理的預處理方法，同時也受到雜交溫度、雜交時間、顯色檢測方法的影響。本研究針對致病性副溶血性弧菌的原位雜交進行了改良和優(yōu)化，得到了副溶血性弧菌較好的預處理條件和雜交條件，副溶血性弧菌的培養(yǎng)：TSA培養(yǎng)基涂布平板于37 ℃培養(yǎng)14 h后影?。活A處理條件：NaOH堿法裂解，80 ℃熱固定2 h；雜交條件：雜交溫度37 ℃，雜交時間8 h，封閉時間1 h，抗體結合1 h，洗脫緩沖液中Tween-20濃度0.2%(體積分數(shù))，顯色液中浸泡8 h后終止顯色反應。