陳 菲， 熊曉宇， 謝明杰

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點實驗室，遼寧 大連 116081)

細菌的耐藥性問題是目前臨床醫(yī)學(xué)面臨的嚴峻問題，而細菌生物被膜(bacterial biofilm，BF) 的形成是導(dǎo)致細菌耐藥和引起細菌持續(xù)性感染的主要致病機制之一[1]。BF是由細菌菌體及胞外的分泌物如多糖和蛋白等相互作用而形成的群體結(jié)構(gòu)，細菌可借由形成的BF逃避機體免疫系統(tǒng)的攻擊和抗菌藥物的殺滅作用，從而形成對抗生素產(chǎn)生耐藥性的超級細菌[2-3]。因此通過控制和破壞細菌生物被膜的形成，是解決細菌耐藥和治療細菌持續(xù)性感染的有效途徑。白花丹素(Plumbagin，PLN)是傳統(tǒng)藥用植物白花丹的主要活性成分，近年來的研究表明，白花丹素具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗癌等多種生物活性[4]。李欣燃等的研究結(jié)果顯示，白花丹素對大腸埃希菌生物被膜有抑制作用[5]，但目前關(guān)于白花丹素對大腸桿菌生物被膜的作用機制研究尚未見相關(guān)報道。本研究以E.coli10389為供試菌株，通過測定白花丹素對藻酸鹽合成的影響及其對rseA和rpoE基因表達量的影響，探討白花丹素對大腸埃希菌生物被膜形成的抑制作用及機制，旨在為解決大腸埃希菌的耐藥問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供試菌株E.coli10389、陰性對照菌株E.coli8739，均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 剛果紅培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑與儀器 白花丹素，純度分析≥90%，購自大連賽拓生物科技有限公司；藻酸鹽標準品、剛果紅、氯化三苯基四氮唑(TTC)、二乙基焦炭酸酯(DEPC)、Real-Time PCR相關(guān)試劑等，購自上海生工生物工程有限公司。IECCL31R Multispeed型超速冷凍離心機，美國Thermo公司；TC512型PCR儀，英國TECHNE公司；實時定量PCR儀Stralagen Mx3005P，美國Agilent公司; 實時熒光定量PCR儀TaKaRa TP800，大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株BF的形成能力 將培養(yǎng)至對數(shù)期的E.coli點接種于剛果紅固體平板表面，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。菌落黑色、光亮和干燥的為產(chǎn)BF菌株；菌落白色、光滑的為不產(chǎn)BF菌株。

1.2.2 供試菌株BF形成過程的測定 用結(jié)晶紫半定量法測定生物膜形成過程：于96孔板中加入200 μLE.coli菌懸液(106cfu/mL)，37 ℃分別培養(yǎng)不同時間后棄上清，PBS洗3次。然后用甲醇固定15 min，每孔加入2%結(jié)晶紫染色8 min。水洗后，每孔再用乙醇∶ 丙酮(80∶ 20)懸浮菌體，于酶標儀570 nm下測定吸光值，每組設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值。用顯微鏡觀察生物被膜形成過程：把無菌載玻片放入12孔板中，每個孔板各加入上述菌懸液1 mL，37 ℃分別培養(yǎng)不同時間后取出載玻片，用結(jié)晶紫染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 白花丹素抑制E.coli10389 BF形成和成熟BF的MIC和MBC測定 在96孔板中分別加入200 μL供試菌懸液(103cfu/mL)，再加入20 μL不同濃度的白花丹素，使其終濃度分別為2、4、8、16、32、64和128 μg/mL，以不加藥物為空白對照。37 ℃培養(yǎng)24 h，每孔分別加入20 μL 0.2%TTC，繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h。以沒有紅色還原物甲瓚產(chǎn)生的最低濃度作為最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)。然后從大于MIC的孔中，分別吸取20 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，以沒有菌落生長的最低濃度作為最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration, MBC)。實驗重復(fù)3次，取平均值。抑制成熟BF的MIC和MBC的測定是在96孔板中先培養(yǎng)成熟的BF后，再加入不同濃度的白花丹素進行測定。

1.2.4 白花丹素對E.coli10389產(chǎn)胞外多糖的影響[6]將E.coli10389菌懸液接種到白花丹素終濃度分別為1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC和2MIC的剛果紅平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，以不含藥平板作為空白對照。

1.2.5 白花丹素對E.coli10389分泌藻酸鹽的影響 于12孔板中的載玻片上培養(yǎng)E.coli10389成熟BF，棄上清后分別加入1 mL終濃度分別為1/4MIC、1/2MIC和MIC的白花丹素，37 ℃培養(yǎng)24 h，將載玻片取出放入離心管中，搗碎后加入600 μL 0.85%的生理鹽水，振蕩培養(yǎng)20 h，12 000 r/min離心30 min。取上清，加入2 mL硫酸硼酸溶液(0.25 mmol/L硼酸，1 mL蒸餾水，9 mL濃硫酸)和500 μL 1%卡唑溶液(1 mg咔唑，10 mL無水乙醇)混勻，沸水加熱30 min后冷卻，用分光光度計測定530 nm的吸光度值，以不加藥組為空白對照。藻酸鹽標準曲線的制作參照文獻[7]，所測得的標準曲線方程：y=0.001 8x-0.001 8，R2=0.998 7。

1.2.6E.coli10389產(chǎn)藻酸鹽合成基因的檢測 利用Primer 5.0軟件及參考文獻[8-9]，設(shè)計rseA和rpoE基因引物。引物序列為(5′→3′)：rseA-F：GTCAACCGGCGACATTGAT；rseA-R：ACGCTGCT-CCTGTACCTGCT；rpoE-F：TGGCTGTATCGGATT-GCTGT；rpoE-R:ACGTGAACGCACCGTACCTA。PCR 擴增條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。

1.2.7 白花丹素對藻酸鹽合成基因rpoE和rseA表達量的影響 將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌懸液接種到白花丹素的終濃度為0、1/4MIC、1/2MIC和MIC的LB培養(yǎng)液中，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h。采用Trizol法提取RNA并對其濃度進行定量。采用兩步法反轉(zhuǎn)合成模板cDNA，根據(jù)rseA和rpoE引物進行擴增，設(shè)置反應(yīng)條件：①95 ℃、30 s；②95 ℃、5 s，53 ℃、30 s ，40個循環(huán)；③95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s。以16S rRNA為內(nèi)參基因。待反應(yīng)結(jié)束后分析RT-PCR的擴增曲線和融解曲線，并計算rseA和rpoE的相對表達量。rseA和rpoE RT-PCR引物序列(5′→3′)：rseA-F：GTCAACCGGCGACATTGAT；rseA-R：GACGCCAA-

CGATAACTGCAA；rpoE-F：TGGATGGCCTGAGCT-

ATGAA；rpoE-R：CGCCTGATAAGCGGTTGAA。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 17.0 及Curve Expert 1.3統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料用率來表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間采用t檢驗。以P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株BF的形成能力和形成時間的測定

剛果紅平板結(jié)果顯示(圖1)，供試的E.coli10389能形成黑色、光亮的干燥菌落，表明該菌株可形成BF。結(jié)晶紫半定量結(jié)果顯示(圖2)，E.coli10389隨著培養(yǎng)時間的增加，BF內(nèi)的細菌數(shù)量逐漸增加，待培養(yǎng)至48 h時其BF內(nèi)的菌量達到最大，表明E.coli10389形成成熟BF的時間為48 h。

圖1 剛果紅平板的鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of the Congo red plate A： E.coli 10389;B：E.coli 8739

圖2 E.coli 10389BF 的形成過程Fig.2 The formation of E.coli 10389 biofilm

2.2 白花丹素抑制供試菌株BF形成和成熟BF的MIC和MBC的測定結(jié)果

實驗結(jié)果顯示(表1)，白花丹素能抑制BF的形成，其抑殺E.coli10389的MIC 和MBC分別為16和64 μg/mL。白花丹素對E.coli10389成熟BF內(nèi)的細菌也有破壞作用，其抑殺E.coli10389成熟生物被膜內(nèi)細菌的MIC 和MBC分別為64和128 μg/mL。

表1 白花丹素抑制供試菌株BF形成和成熟BF內(nèi)細菌的MIC和MBC

注：“-”表示沒有菌生長; “+”表示有菌生長

2.3 白花丹素對E.coli10389產(chǎn)胞外多糖的影響

剛果紅平板結(jié)果顯示(圖3)，隨著白花丹素濃度的增加，E.coli10389產(chǎn)胞外多糖的量逐漸減少。藻酸鹽含量的測定結(jié)果顯示(圖4)，白花丹素能抑制E.coli10389藻酸鹽的合成，其中1/2MIC的白花丹素作用E.coli10389 24 h后，與對照組相比，藻酸鹽的含量降低了34.83%(P<0.01)。

圖3 白花丹素對E.coli 10389胞外多糖的影響Fig.3 Effect of E.coli 10389 extracellular polysaccharide expression by PLN

2.4 白花丹素對rseA和rpoE 表達量的影響

由于rseA和rpoE基因為藻酸鹽合成的調(diào)控基因，本研究首先證明E.coli10389菌株中是否存在rpoE和rseA基因，并采用RT-PCR法測定白花丹素對E.coli10389 菌株rpoE和rseA基因表達量的影響。結(jié)果顯示，在供試菌株中存在與藻酸鹽合成相關(guān)的rpoE和rseA基因 (圖5)。

RT-PCR結(jié)果顯示(圖6)，白花丹素能降低E.coli10389rseA和rpoE基因的相對表達量，其中1/2MIC的白花丹素作用E.coli10389 24 h后，與對照組相比，rseA的表達量上調(diào)了17.43%，rpoE的表達量降低了12.8%(P<0.05)。

圖4 白花丹素對藻酸鹽含量的影響Fig.4 Effect of alginate content by PLN 與對照組相比，*P<0.01*P<0.01, compared with control group

圖5 E.coli 10389 rseA和rpoE基因的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.5 Agarose gel electrophoresis of E.coli 10389 genes rseA and rpoE

圖6 白花丹素E.coli 10389 rseA和rpoE表達量的影響 與對照組相比，*P<0.05Fig.6 Expression of rseA and rpoE in E.coli 10389 to PLN與對照組相比，*P<0.05*P<0.05, compared with control group

3 討 論

由于細菌在成熟條件下都可以形成生物被膜，因此BF的形成是造成院內(nèi)細菌持續(xù)性感染的主要原因之一。BF一旦形成，其對抗生素和消毒劑的抵抗能力要比浮游菌顯著增強。目前臨床分離的大腸埃希菌形成BF的概率極高，黃璨等[10]的研究結(jié)果顯示，川貝母可顯著抑制大腸埃希菌生物被膜的形成。本研究結(jié)果也證明，白花丹素對大腸埃希菌生物被膜的形成以及成熟生物被膜內(nèi)的大腸埃希菌有抑制和殺滅作用。

大腸埃希菌BF的形成過程包括定殖、黏附、聚集、成熟和播散5個階段，其中藻酸鹽等胞外多糖的合成和分泌在BF形成的黏附和聚集階段發(fā)揮重要作用，是維持BF穩(wěn)定性的主要組成成分[11-12]。藻酸鹽是一種陰離子黏性多糖蛋白復(fù)合物，幾乎所有的細菌都能分泌藻酸鹽。有研究表明，可以通過藥物破壞藻酸鹽多糖蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，來清除和破壞細菌的生物被膜，以達到防治細菌生物被膜造成的感染[13-15]。本研究結(jié)果顯示，白花丹素能抑制E.coli10389藻酸鹽的合成量。其中1/2MIC的白花丹素作用E.coli10389 24 h后，與對照組相比，藻酸鹽的合成量降低了34.83%(P<0.01)。

藻酸鹽的合成受許多基因調(diào)控，有研究表明，在E.coli中，rpoE基因編碼的產(chǎn)物可以激活藻酸鹽合成基因的啟動子，促進藻酸鹽的合成；而rseA能編碼螯合激活子的蛋白抑制藻酸鹽的表達[16-18]。本研究結(jié)果顯示，白花丹素能降低rpoE的表達量，促進rseA的表達量，表明白花丹素抑制E.coli10389藻酸鹽的合成與rseA和rpoE有關(guān)。

綜上所述，白花丹素能夠抑制E.coli10389 BF的形成，其作用機制是通過影響藻酸鹽合成的rseA和rpoE基因，抑制藻酸鹽的合成量來影響E.coli10389 BF的形成。由于BF的形成是受多種因子和多基因共同調(diào)控的過程，因此關(guān)于白花丹素抑制BF形成的其他作用機制還有待進一步研究。