肖支葉， 陳麗英， 原曉龍， 華 梅， 邱 堅， 鄭 科， 王 毅*

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院 云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室，國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點實驗室，云南 昆明 650201；2.西南林業(yè)大學(xué) 材料工程學(xué)院，云南 昆明 650224；3.普洱市林業(yè)管理服務(wù)中心，云南 普洱 665000)

植物病原真菌是引起植物病害的主要病原微生物，但有些病原真菌給農(nóng)林業(yè)帶來破壞的同時也給人類帶來廣泛的藥用價值。據(jù)文獻(xiàn)報道，部分植物病原真菌本身或其引起的植物病害組織具有藥用價值，如利尿、止血、抗菌、抗腫瘤、清熱解毒等藥理作用[1]。多脂長喙殼菌(Ceratocystisadiposa)為長喙殼屬真菌，該屬真菌廣泛分布在世界各地，是農(nóng)作物和樹木上的重要病原真菌[2]，會產(chǎn)生多種揮發(fā)性有機化合物。在不同的培養(yǎng)條件下，該類真菌能產(chǎn)生大量類似水果或花卉的芳香物質(zhì)，如菠蘿、香蕉、蘋果、檸檬和玫瑰的香味[3-6]。研究表明，甘薯長喙殼菌在生長過程中能夠產(chǎn)生濃郁的近似香蕉氣味的揮發(fā)性有機化合物[7-8]，該類化合物對多種植物病原真菌具有較強的抑制作用[9]。多脂長喙殼菌通過甘蔗的切口、蔗樁侵入，感病后會散發(fā)出濃郁的菠蘿香味[10]。真菌代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性有機化合物主要是次生代謝產(chǎn)物，已被開發(fā)成綠色能源物質(zhì)[11]，用于植物病蟲害的防治，也作為化學(xué)信息素引誘或趨避昆蟲和無脊椎動物[12]。長喙殼屬真菌具有的特殊代謝機制，使得這類真菌具有多種潛在應(yīng)用價值。真菌廣泛分布在自然環(huán)境中，種類十分豐富[13]。其次生代謝產(chǎn)物具有多種生物活性，可開發(fā)成不同類型的藥物。真菌次生代謝產(chǎn)物是科研人員研究微生物的主要對象，當(dāng)前研究較多的是植物內(nèi)生真菌和昆蟲共生菌[14-16]，從它們體內(nèi)或發(fā)酵物中分離獲得生物堿類、萜類、醌類、甾體、酚類、肽類等具有不同生物活性的化合物[17]。因此，真菌能夠成為人們尋找具有生物活性化合物的重要來源。例如人類醫(yī)療中常用的抗生素—青霉素就來源于真菌，它是由英國細(xì)菌學(xué)家Fleming于1929年發(fā)現(xiàn)[18]，芐基青霉素的出現(xiàn)實現(xiàn)了青霉素工業(yè)化生產(chǎn)[19]，極大地促進(jìn)人類醫(yī)學(xué)發(fā)展。1993年，Strobel等[20]首次從紅豆杉(Taxmbrevifolia)樹皮中分離獲得安德氏紫杉霉(Taxomycesandreanane)，該內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生一種萜類化合物—紫杉醇，是當(dāng)今世界公認(rèn)活性最為有效的抗腫瘤藥物。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)單格孢屬內(nèi)生真菌(Ulocladiumsp.)發(fā)酵液提取物對白色念珠菌、曲霉菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌等真菌和細(xì)菌具有很好的抗菌活性。多脂長喙殼菌是甘蔗黑腐病的病原菌[10]，目前未見其次生代謝產(chǎn)物的抗菌活性的報道。本研究首先檢測多脂長喙殼菌對13種致病細(xì)菌的抑菌活性，測定最低抑菌濃度，并檢測提取物抗菌化合物的穩(wěn)定性，同時用單菌多產(chǎn)物(one strain-many compounds，OSMAC)策略液體培養(yǎng)多脂長喙殼菌，濃縮培養(yǎng)液獲得提取物，檢測抑菌活性，探究最佳培養(yǎng)條件，為定向培養(yǎng)植物病原真菌、分離提純活性化合物的研究作鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 供試致病細(xì)菌為蠟樣芽胞桿菌 (Bacilluscereus)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)、藤黃微球菌 (Micrococcusluteus) 、副溶血性弧菌 (Vibrioparahaemolyticus)、短小芽胞桿菌 (Bacilluspumilus)、大腸埃希菌 (Escherichiacoli)、福氏志賀氏菌 (Shigellaflexneri)、枯草芽胞桿菌 (Bacillussubtilis)、溶血性葡萄球菌 (Straphylococcushaemolyticus)、無乳鏈球菌 (Streptcococcusagalactiae)、緩慢芽胞桿菌 (Bacilluslentus)、乙型副傷寒沙門氏菌 (SalmonellaparatyphiB)，由昆明市食品藥品檢驗所贈送；多脂長喙殼菌由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室贈送。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①不同氮源培養(yǎng)基：葡萄糖2 g/L，蔗糖6 g/L為碳源，編號為G與S，以4 g/L的胰蛋白胨Y1、酵母粉Y2、麥芽浸粉M1、麥芽浸粉肉湯M2、牛肉浸粉B、馬鈴薯浸粉P、酪蛋白胨L、大豆蛋白胨S、番茄浸粉T、馬鈴薯浸粉和大豆蛋白胨P-S為氮源，配制成碳源相同氮源不同的液體培養(yǎng)基。②OMAM培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蔗糖20 g/L為碳源，大豆蛋白胨20 g/L和酵母粉1 g/L為氮源。

1.2 方法

1.2.1 制備提取物 用100 mL液體培養(yǎng)基GSY1、GSY2、GSM1、GSM2、GSB、GSP、GSL、GSS、GST、GSP-S、OMAM分別培養(yǎng)多脂長喙殼菌，28 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)10 d后，用等體積的乙酸乙酯萃取2次，濾去水相，取有機相濃縮培養(yǎng)液，收獲提取物，分別稱取適量提取物，加入DMSO溶解成50 mg/mL提取物溶液備用。

1.2.2 檢測提取物抗菌活性 制備供試菌懸浮液：分別將13種供試菌株接種于固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h活化菌株，再挑取單菌落接種到5 mL液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min進(jìn)行斜面培養(yǎng)，至菌液濃度達(dá)到 (1×106～6×106)cfu/mL，備用。抑菌實驗用紙片法[22]。將各菌液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上，分別滴加10 μL多脂長喙殼菌不同提取物溶液于濾紙片(φ=5 mm)上，同時一片濾紙片滴加10 μL DMSO作為陰性對照，揮干后貼在涂有供試菌的培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。3次技術(shù)重復(fù)實驗。測定最小抑菌活性(MIC)：采用二倍稀釋法[23]，測定活性提取物的MIC值。

1.2.3 提取物穩(wěn)定性檢測 配制15份50 mg/mL的多脂長喙殼菌提取物DMSO溶液，檢測多脂長喙殼菌提取物的熱、酸堿和光穩(wěn)定性。①：熱穩(wěn)定性檢測：在30、50、70、90、100 ℃熱水中分別處理1份，水浴加熱30 min，備用。②酸堿穩(wěn)定性檢測：各調(diào)一份提取物溶液的pH值至3、5、7、9、11，備用。③光穩(wěn)定性檢測：取5份提取物溶液置于紫外燈下照射30、60、90、120、150 min，備用。用紙片法檢測處理后的提取物抗菌活性，均做3次技術(shù)性重復(fù)實驗。

1.2.4 OSMAC策略尋找最佳培養(yǎng)條件 以不同時間、接種量和培養(yǎng)基分別培養(yǎng)多脂長喙殼菌，對其不同的提取物做活性檢測，具體如下：無菌條件下，研碎多脂長喙殼菌菌體。不同培養(yǎng)基：分別接種在GSY1、GSY2、GSM1、GSM2、GSB、GSP、GSL、GSS、GST、GSP-S、OMAM液體培養(yǎng)基中；不同時間：在GSL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5、10、15、20和25 d各一份；不同接種量：研碎0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 g菌體各一份，在GSL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)10 d后，收獲培養(yǎng)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測多脂長喙殼菌提取物抑菌活性

活性檢測結(jié)果表明，多脂長喙殼菌提取物對13種致病細(xì)菌中的3種革蘭陽性菌(蠟樣芽胞桿菌、緩慢芽胞桿菌和藤黃微球菌)具有明顯的抑菌活性，抑菌圈直徑分別為8.1、8.0、8.7 mm。多脂長喙殼菌提取物中含有有效的抗菌物質(zhì)。多脂長喙殼菌提取物對蠟樣芽胞桿菌、緩慢芽胞桿菌和藤黃微球菌的MIC均不相同，分別為6.25、1.562 5、3.125 mg/mL。MIC越小，說明致病細(xì)菌對提取物的敏感性越大，致病菌對多脂長喙殼菌提取物的敏感性大小為蠟樣芽胞桿菌<藤黃微球菌<緩慢芽胞桿菌。多脂長喙殼菌次生代謝產(chǎn)物中的活性成分對革蘭陽性菌有著較好的抗菌作用。

2.2 多脂長喙殼菌提取物穩(wěn)定性

如圖1所示，多脂長喙殼菌提取物溶液經(jīng)過不同溫度處理、調(diào)節(jié)pH值和紫外光照射不同時間后，對蠟樣芽胞桿菌和藤黃微球菌仍具有抗菌活性，對緩慢芽胞桿菌無抗菌活性。藤黃微球菌對多脂長喙殼菌提取物的敏感性高。隨著溫度升高，pH值增大，紫外光照時間的增加，提取物對蠟樣芽胞桿菌和藤黃微球菌的抑菌活性變化較小，抑菌圈直徑呈現(xiàn)上下浮動的趨勢，沒有明顯增大或減小，抑菌效果相似，可以斷定多脂長喙殼菌提取物含有有效抑菌成分并且具有耐高溫、耐酸堿和耐紫外輻射的能力。

圖1 多脂長喙殼菌提取物處理后的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of C. adiposa extract after treatment

2.3 不同培養(yǎng)基對多脂長喙殼菌提取物的抑菌活性比較

多脂長喙殼菌在10種液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，乙酸乙酯萃取濃縮所得提取物對3種致病菌的抑制效果見表1。液體培養(yǎng)基GSB、GSL、GSM1、GST、GSP、GSY1、GSY2、OMAM均可使多脂長喙殼菌產(chǎn)生對蠟樣芽胞桿菌、緩慢芽胞桿菌、藤黃微球菌有抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物，抗菌實驗表明，不同培養(yǎng)基培養(yǎng)多脂長喙殼菌獲得的提取物對蠟樣芽胞桿菌和藤黃微球菌的抑菌效果區(qū)別明顯，對緩慢芽胞桿菌有廣譜抗菌活性，GSL是最佳培養(yǎng)基。GSM2、GSS培養(yǎng)多脂長喙殼菌的提取物對3種致病菌具有不同的抗菌活性。

2.4 接種量對多脂長喙殼菌提取物抑菌效果

多脂長喙殼菌不同接種量培養(yǎng)10 d后收獲提取物，由圖2可知，活性實驗表明接種量會影響多脂長喙殼菌提取物對三種致病菌的抗菌活性。隨著接種量的增加，提取物的抗菌活性有所增大，接種0.4 g此菌絲體培養(yǎng)收獲的提取物開始有抗菌活性，接種量在1.6 g時，提取物能夠明顯抑制藤黃微球菌的生長，對三種致病菌的抑菌效果最好。繼續(xù)增大接種量，提取物抑菌活性降低。在不同接種量下，提取物對藤黃微球菌的抗菌效果始終優(yōu)于蠟樣芽胞桿菌和緩慢芽胞桿菌，對蠟樣芽胞桿菌和緩慢芽胞桿菌的抗菌效果相似，可以看出，藤黃微球菌對多脂長喙殼菌提取物的敏感性較高。

表1 不同液體培養(yǎng)基乙酸乙酯濃縮物抑菌活性

注: “-”表示無抗菌活性

圖2 接種量對提取物抑菌活性的影響

抑菌圈值為測得的抑菌圈直徑與圓紙片直徑的差值，下圖同

The value of inhibition zone is measured diameter difference between inhibition zone and round paper

2.5 培養(yǎng)時間對多脂長喙殼菌提取物抑菌效果

經(jīng)過不同時間培養(yǎng)獲得的提取物的抑菌效果如圖3，多脂長喙殼菌培養(yǎng)5 d即產(chǎn)生活性次生代謝產(chǎn)物，10 d活性達(dá)到最高，提取物的抑菌效果最好。隨后抑菌活性呈現(xiàn)略微下降的趨勢，25 d時沒有抗菌活性，原因可能是培養(yǎng)時間過長，多脂長喙殼菌代謝出多種次生代謝產(chǎn)物，可能產(chǎn)生其他的化合物破壞了次生代謝產(chǎn)物中對致病細(xì)菌有抗菌活性的化學(xué)物質(zhì)，從而失去抗菌活性。培養(yǎng)時間會影響該真菌提取物的抑菌活性。

圖3 時間對提取物抑菌活性的影響Fig.3 Antibacterial activity of extracts in different culture time

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，GSL培養(yǎng)多脂長喙殼菌獲得的提取物的抑菌效果最好，抑菌圈直徑9.7 mm，而GSM2和GSS培養(yǎng)多脂長喙殼菌得到的提取物無抑菌活性(表1)。培養(yǎng)基對多脂長喙殼菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的抗菌活性有影響，其原因可能是該菌株在不同的培養(yǎng)基中產(chǎn)生不同類型的次生代謝產(chǎn)物或次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量不同。接種量和培養(yǎng)時間也會影響多脂長喙殼菌次生代謝產(chǎn)物的抑菌效果。因此，改變培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件均會影響多脂長喙殼菌抗菌活性成分的產(chǎn)生。

從微生物中篩選天然來源活性化合物是尋找新藥前體化合物的有效途徑之一。2002年，Bode等[24]提出單菌多產(chǎn)物策略(OSMAC)，該策略通過改變培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方法和添加酶抑制劑等手段，激活微生物中沉默的生物合成基因簇，從而獲得結(jié)構(gòu)新穎、活性高的新化合物。OSMAC策略為廣泛開發(fā)微生物來源的天然產(chǎn)物提供了有效手段。盧軒等[25]對單菌多產(chǎn)物策略研究成果做了綜述，利用該策略已經(jīng)在不同生態(tài)環(huán)境生存的微生物的次級代謝產(chǎn)物的研究中獲得成功，已發(fā)現(xiàn)多種活性化合物。Nielsen等[26]用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)，HPLC分析表明構(gòu)巢曲霉在查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基(CYA)中會產(chǎn)生arugosin A，而在酵母膏培養(yǎng)基(YE)中不會產(chǎn)生arugosin A，說明培養(yǎng)基種類會影響構(gòu)巢曲霉次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。肖支葉等[27]報道應(yīng)用OSMAC方法研究了云南松小蠹蟲共生菌Leptographiumbhutanense，發(fā)現(xiàn)其提取物中含有抗菌物質(zhì)，抗菌化合物具有較好的耐熱和耐輻射性。OSMAC策略對微生物中大量代謝途徑的表達(dá)有促進(jìn)作用，改變微生物發(fā)酵條件可促使其產(chǎn)生多種類型的化合物，在微生物次生代謝產(chǎn)物的研究中具有廣泛的適用性。

目前已經(jīng)確定具有藥用價值的植物病原真菌僅有數(shù)十種，而植物病原真菌的種類達(dá)8 000種以上[13]，可以看出，研究過的植物致病真菌數(shù)量很少，研究前景十分廣闊。關(guān)于植物病原真菌代謝產(chǎn)物的報道集中在具有藥用價值的一些植物病原真菌，對其毒素、致病機制、群體遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等方面的研究較多[28-31]，忽略了其對人類有益的方面。從真菌中發(fā)掘結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的次生代謝產(chǎn)物是當(dāng)前的一個研究熱點，應(yīng)用OSMAC策略研究植物病原真菌次生代謝產(chǎn)物可豐富微生物研究內(nèi)容，同時為尋找天然來源的新型抗生素先導(dǎo)化合物增加一條可能的途徑。多脂長喙殼菌發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物抗菌活性尚屬首次報道，其提取物中含有有效抗菌成分。本研究可為后續(xù)分離純化活性物質(zhì)提供理論基礎(chǔ)，也可為植物病原真菌活性次生代謝產(chǎn)物的研究提供參考。