洪霞，賴小芳，邱莉萍，米敏，劉也楠，陳銀龍

(臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 臨海 317000)

三葉青為葡萄科崖爬藤屬，又名金線吊葫蘆、石猴子、石老鼠、蛇附子，塊根或全草均可入藥，具有消炎解毒、鎮(zhèn)痛解熱、抗癌、護(hù)肝等功效，有較高的藥用價(jià)值[1-2]。臨床上三葉青常用于治療小兒高熱、扁桃體炎、支氣管炎、肺炎、肝炎、心腦血管疾病、腫瘤等[3-5]。野生三葉青分布廣泛，主要有紫藤與青藤2個(gè)品種，生長(zhǎng)區(qū)域界限明顯，不混生[6]。由于野生資源多年來(lái)遭受采挖，導(dǎo)致日益稀少，在浙江省已被列入保護(hù)名錄[7]。目前，多地已著手開展三葉青人工栽培與品種選育的研究，以滿足日益增長(zhǎng)的藥材需求。本試驗(yàn)收集了野生紫藤三葉青的2個(gè)生態(tài)品種進(jìn)行人工栽培，開展生長(zhǎng)發(fā)育以及不同生長(zhǎng)年限、不同部位總黃酮含量的研究，為三葉青優(yōu)良品種選育以及收獲年限提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年于浙江臺(tái)州黃巖引入野生三葉青資源，分別為窄葉、闊葉2種生態(tài)型三葉青。窄葉三葉青與闊葉三葉青均為紫藤，葉片表面無(wú)毛。窄葉三葉青葉片狹長(zhǎng)，深綠色，主葉脈正中對(duì)稱；闊葉三葉青葉片較寬，淺綠色，主葉脈左右不對(duì)稱。引入的野生闊葉三葉青塊根用于總黃酮含量測(cè)定方法學(xué)考察。2種野生三葉青進(jìn)行扦插育苗、移栽，連續(xù)3年收獲不同生長(zhǎng)年限的三葉青材料。

1.2 儀器與試劑

紫外分光光度計(jì)(UV-3100PC，Mapada)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY 92-IIN，寧波新芝)；60目篩；電子天平(AL104)，梅特勒-托利多儀器；恒溫干燥箱(上海博訊)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)10080-201409)；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司。

1.3 種植、收獲與性狀考察

2014年4月取三葉青莖段進(jìn)行扦插，以金色3號(hào)為育苗基質(zhì)，等成活出根，于當(dāng)年7月取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行移栽。采用控根容器栽培，直徑30 cm，深度30 cm。以園土∶菌渣∶珍珠巖(5∶1∶1)，混合后作為栽培基質(zhì)裝填種植，每個(gè)控根容器均勻種植3株。闊葉三葉青與窄葉三葉青各種植25個(gè)控根容器，人工遮陰，統(tǒng)一管理。每年的7月中旬隨機(jī)收獲5個(gè)單株，對(duì)主蔓長(zhǎng)度、分枝數(shù)、莖葉鮮重、T/R(地上部鮮重/塊根總重)比值、單株塊根數(shù)、單株塊根總重(鮮重)這6個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行了考察?？疾旌?，將5個(gè)單株按照塊根、藤莖、葉片分開并混合，放入恒溫干燥箱105 ℃殺青20 min，50 ℃烘干至恒重備用。

1.4 總黃酮含量測(cè)定

1.4.1 供試品溶液制備

烘干后的三葉青樣品用液氮磨成細(xì)粉后，過(guò)60目篩，精密稱取0.15 g，加入5 mL 60%乙醇，超聲破碎40 min，功率400 W，保護(hù)溫度60 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，取上清。使用60%乙醇定容至5 mL。重復(fù)操作3次。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取0.005 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加入25 mL 25%酒精超聲溶解，配制成0.2 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.3 測(cè)試波長(zhǎng)選擇

取500 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液與100 μL供試品溶液，分別加入100 μL 5%硝酸鈉，混勻，靜置5 min，加入100 μL 10%硝酸鋁，混勻，靜置5 min，加入1 mL 10% NaOH溶液混勻，最后加入60%乙醇適量，定容至2.5 mL，靜置15 min，標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)液與供試品反應(yīng)液均在200～800 nm進(jìn)行吸光度掃描，總黃酮均在502 nm處有最大吸收波長(zhǎng)。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參照鄭軍獻(xiàn)等[8]報(bào)道的方法進(jìn)行優(yōu)化測(cè)定。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、200、400、500、600、700、800、1 200 μL，按照1.4.3的反應(yīng)方法，反應(yīng)溶液在502 nm處測(cè)定吸光值。得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=11.455x×0.009 5，r=0.997，蘆丁在0.004～0.096 mg·mL-1濃度與吸光值之間有良好的線性關(guān)系。

1.4.5 方法學(xué)考察

精密度與穩(wěn)定性。連續(xù)6次測(cè)定反應(yīng)液的吸光值，計(jì)算得r值為0.57%，顯示儀器的精密度良好。取測(cè)試波長(zhǎng)的供試品反應(yīng)液在10、20、40、60、80、90 min分別測(cè)定吸光值，得R值為1.96%，樣品反應(yīng)液在1.5 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

方法重現(xiàn)性。平行操作6次，測(cè)定樣品的黃酮含量。6次測(cè)定的黃酮含量分別為14.41、13.41、14.28、14.18、14.11、13.97 mg·g-1，均值14.06 mg·g-1，得r值為2.5%。

加樣回收。精密稱取已知含量為14.06 mg·g-1的樣品0.15 g共6份，加入適量的蘆丁對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備溶液，按1.4.3節(jié)操作，于502 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算得6次回收率分別為98.61%、96.83%、97.02%、95.13%、102.73%、99.43%，r值為2.67%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，顯著性差異比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)年限三葉青農(nóng)藝性狀的比較

由表1可知，2種生態(tài)型三葉青隨著生長(zhǎng)年限的增加，單株的塊根產(chǎn)量穩(wěn)步上升，尤其是從第1～2年，單株塊根個(gè)數(shù)顯著增加，分別增長(zhǎng)73.13%與130.51%，而從第2～3年，單株的塊根個(gè)數(shù)沒(méi)有顯著增加，主要是單個(gè)塊根的重量增長(zhǎng)。地上部的莖葉鮮重二年生三葉青顯著大于一年生，三年生與二年生沒(méi)有顯著差異，莖葉鮮重的增長(zhǎng)主要是主蔓長(zhǎng)度的顯著增加，分枝數(shù)沒(méi)有顯著差異。二年生的T/R比值與一年生相比顯著下降。由上述得知，三葉青從第1～2年期間是快速生長(zhǎng)累積階段，而第2～3年長(zhǎng)勢(shì)趨于緩和，地上部生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，但塊根產(chǎn)量繼續(xù)增加。

表1 2種生態(tài)型三葉青農(nóng)藝性狀的比較

闊葉三葉青無(wú)論是一年生、二年生還是三年生，單株產(chǎn)量均高于窄葉三葉青。二年生與三年生的莖葉鮮重、塊根總重顯著高于窄葉三葉青，其中二年生樣品差異達(dá)到極顯著水平，2種生態(tài)型莖葉鮮重的差異主要由分枝數(shù)的差異所致，達(dá)到顯著水平。

2.2 總黃酮含量的變化與比較

由圖1可知，三葉青不同部位的黃酮積累量并不相同，以藤莖中的含量為最高。第1～2年黃酮含量變化最為顯著，第2～3年則相對(duì)穩(wěn)定。其中，二、三年生的三葉青塊根黃酮含量顯著低于一年生。二、三年生的藤莖、葉片黃酮?jiǎng)t顯著高于一年生。比較窄葉三葉青與闊葉三葉青黃酮含量發(fā)現(xiàn)，窄葉三葉青的黃酮含量除二年生與三年生的葉片外，其他不同年限、不同組織樣品均顯著高于相應(yīng)的闊葉三葉青樣品，其中以塊根與藤莖中黃酮含量差異最大，達(dá)極顯著水平。隨著生長(zhǎng)年限的延長(zhǎng)，在塊根中窄葉的總黃酮含量比闊葉依次高77.53%、29.89%、31.72%，在藤莖中則依次高出30.29%、31.93%、31.07%。

圖1 2種生態(tài)型三葉青總黃酮含量的比較

3 討論

三葉青作為重要的中藥材入選新“浙八味”，一直以來(lái)以塊根入藥。野生的三葉青資源生長(zhǎng)年限不清，無(wú)法為人工栽培經(jīng)濟(jì)效益的提高提供理論依據(jù)。本研究對(duì)三葉青進(jìn)行人工栽培，對(duì)不同生長(zhǎng)年限的產(chǎn)量，有效成分含量進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。一年生的三葉青雖然單位質(zhì)量有效成分總黃酮含量高，但塊根數(shù)量少，產(chǎn)量低，經(jīng)濟(jì)效益低下；而二、三年生三葉青產(chǎn)量增加極為顯著，且二、三年生有效成分含量趨向穩(wěn)定，適宜收獲，尤其以三年生三葉青為最好。產(chǎn)量的逐年增加與已有研究具有一致性，而增幅差異可能與人工栽培方式的不同有關(guān)，這表明通過(guò)改善栽培方式能提高三葉青產(chǎn)量[9-10]。此外，關(guān)于三葉青總黃酮的研究多在塊根上[11-13]。本研究通過(guò)對(duì)不同部位總黃酮含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在藤莖與葉片中的總黃酮含量積累也較高。結(jié)合產(chǎn)量農(nóng)藝性狀分析可知，藤莖中總黃酮含量逐年增加，可能因?yàn)樘偾o較細(xì)小，生長(zhǎng)慢，有效成分有逐年累積的趨勢(shì)；塊根從第1～2年快速增長(zhǎng)，導(dǎo)致單位質(zhì)量總黃酮含量顯著下降；葉片新老交替快，黃酮含量變化較小。綜上所述，三葉青全株積累有效成分類黃酮，適宜全草入藥，以三年生三葉青經(jīng)濟(jì)效益高，適宜采收。

三葉青野生資源豐富，不同產(chǎn)地的三葉青有效成分含量并不相同，與生長(zhǎng)環(huán)境有著必然聯(lián)系。有研究表明，浙江產(chǎn)三葉青有效成分比廣西產(chǎn)量高[7]，可見(jiàn)從野生三葉青資源能發(fā)掘優(yōu)良種質(zhì)。本研究引入的2種生態(tài)型三葉青分別表現(xiàn)為闊葉淺綠與窄葉深綠，其中窄葉三葉青總黃酮含量要高于闊葉三葉青，即品質(zhì)較好，但闊葉三葉青在產(chǎn)量上明顯優(yōu)于窄葉三葉青，即產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益要高?？梢?jiàn)，高產(chǎn)的三葉青資源并不意味著有效成分含量高。窄葉深綠性狀是否與高有效成分含量相關(guān)，闊葉淺綠性狀是否與高產(chǎn)相關(guān)仍值得深入研究。

4 小結(jié)

本研究表明，人工栽培三年生的三葉青塊根產(chǎn)量高，經(jīng)濟(jì)效益好，適合采收。三葉青塊根、藤莖、葉片中均積累了較高含量的有效成分類黃酮，適宜全株入藥。窄葉與闊葉2種生態(tài)型三葉青進(jìn)行統(tǒng)一人工栽培后，產(chǎn)量、有效成分并不相同，闊葉三葉青產(chǎn)量高，但有效成分含量低于窄葉三葉青，這對(duì)于從野生三葉青資源選育三葉青新品種意義重大。