馬 蘭，王淑娟，曾海娟，謝曼曼，丁承超，翟緒昭，郭 亮，孫靜娟，李 杰，胡 謙，劉 箐*

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

近年來，快速檢測需求的增加刺激了新技術(shù)在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測和食品安全分析等領(lǐng)域的發(fā)展。目前已有很多技術(shù)可用于檢測小分子和生物大分子，包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、高效液相色譜技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)和生物傳感器技術(shù)等。這些技術(shù)大都特異性強(qiáng)、靈敏度高，但耗時長且需要昂貴的儀器以及專業(yè)的操作人員。和傳統(tǒng)方法相比，側(cè)流層析技術(shù)（lateral flow chromatographic assay，LFCA）有很多優(yōu)勢，如成本低、易操作、快速、可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測及結(jié)果肉眼可見等[1-3]?；谏鲜鰞?yōu)勢，自LFCA出現(xiàn)以來，其在基礎(chǔ)及應(yīng)用研究領(lǐng)域取得了快速的發(fā)展。

1980年首次研制出檢測人絨毛膜促性腺激素的LFCA試紙被用以診斷早孕。自此以后，LFCA被廣泛的運(yùn)用于檢測各種分子，包括腫瘤標(biāo)志物、微生物、霉菌毒素、重金屬和農(nóng)藥等。本文主要從LFCA的原理、技術(shù)結(jié)構(gòu)、研究動態(tài)等方面予以闡述。

1 LFCA的技術(shù)原理及設(shè)計

LFCA主要是基于免疫識別或者核酸雜交以及抗體標(biāo)記技術(shù)，使待檢測物中各組分（抗原、抗體、蛋白質(zhì)、核酸等）通過毛細(xì)管作用力的移動速度差異，在反應(yīng)基質(zhì)上實(shí)現(xiàn)分離的色譜系統(tǒng)[4-6]。

1.1 LFCA的基本組成

LFCA由4 個部分組成，即樣品墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊，將這4 個部分疊加于支撐底板上就構(gòu)成了一個簡易的LFCA試紙條（圖1）。樣品墊為經(jīng)過處理的纖維膜或玻璃棉，用于快速吸收待檢樣品，使其利用毛細(xì)管作用向結(jié)合墊方向側(cè)向流動。結(jié)合墊為纖維膜或玻璃棉，吸附有標(biāo)記的生物活性材料（如金標(biāo)抗體），它可與待檢樣品溶液里的檢測靶標(biāo)結(jié)合形成肉眼可見的免疫復(fù)合物。層析膜大都為硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜，它是LFCA的關(guān)鍵材料，為分析物之間的反應(yīng)提供了平臺，其上固定有兩條或多條不同生物活性物質(zhì)（如抗原或抗體）噴印的“檢測（test，T）線”和“質(zhì)控（control，C）線”，用于攔截帶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，并可直觀地顯示檢測結(jié)果。吸水墊為吸水紙板，用于吸收流過層析膜的待檢樣品，以平衡層析膜兩邊的壓差，促使更多待檢樣品在層析膜上側(cè)向流動[7]。

圖 1 LFCA試紙條結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Structural diagram of LFCA test strip

LFCA是一項基于抗原抗體特異性結(jié)合或核酸探針和靶向核酸雜交反應(yīng)來檢測樣品中目標(biāo)物質(zhì)的有效技術(shù)。其中，當(dāng)抗體被用作生物識別因素時，LFCA又叫免疫層析試紙快速檢測技術(shù)。它是一種20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的將標(biāo)記免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)結(jié)合起來的固相膜免疫分析方法，依據(jù)其免疫層析反應(yīng)時抗原與抗體結(jié)合方式的不同，主要分為兩類，即雙抗體夾心免疫層析法和競爭免疫層析法[8]。

1.2 基于抗體抗原結(jié)合的LFCA

1.2.1 雙抗體夾心免疫層析技術(shù)原理

由于含有較多的抗原位點(diǎn)，雙抗體夾心法適用于檢測大分子物質(zhì)。該模式中使用了3 種抗體：第一種是被標(biāo)記材料標(biāo)記在結(jié)合墊上的將與樣品中抗原特異性結(jié)合的單克隆抗體1（monoclonal antibody 1，mAb1）；第二種是噴印在T線上的與不同抗原決定簇結(jié)合的捕獲單克隆抗體2（monoclonal antibody 2，mAb2）或多克隆抗體（polyclonal antibody，pAb）；第三種是被噴印在C線上的抗種屬特異性免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）的“抗抗體”（俗稱二抗）。

以膠體金標(biāo)記法為例，其檢測原理如下：利用待測抗原上的兩個抗原決定簇A和B分別與結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體和T線上的捕獲抗體結(jié)合，形成“金標(biāo)抗體（mAb1）-待測抗原-捕獲抗體（mAb2或pAb）”復(fù)合物；該復(fù)合物因為有膠體金的緣故而顯紅色，復(fù)合物的形成量與待測抗原含量成正比[9]，C線將未被T線攔截的金標(biāo)抗體mAb1及部分抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物攔截并反應(yīng)顯色。于是，當(dāng)?shù)渭拥綐悠穳|上的待測樣品通過毛細(xì)管作用向前層析到結(jié)合墊上時，會溶解其上的金標(biāo)抗體并一同向前涌動：如果樣品中含有抗原，T線和C線均會顯現(xiàn)紅色；反之，T線無條帶，C線顯紅色（圖2）；C線不顯色則結(jié)果不能判斷。

圖 2 雙抗體夾心LFCA原理圖[10]Fig. 2 Schematic diagram for the principle of sandwich LFCA[10]

1.2.2 競爭免疫層析法原理

小分子不能同時結(jié)合兩種及兩種以上的抗體，而競爭法檢測模式為競爭抑制性的免疫學(xué)結(jié)合反應(yīng)，所以競爭法適用于抗原位點(diǎn)較少或僅有單個抗原位點(diǎn)的小分子化合物的檢測。該方法中使用了兩種抗體，一種是與樣品中抗原特異性結(jié)合的抗體，另一種是噴印在C線上的二抗。與雙抗體夾心法不同的是，競爭免疫層析法試紙條結(jié)果表現(xiàn)為：若樣品中無靶標(biāo)抗原，則T線和C線處均顯現(xiàn)條帶；反之，若樣品中有靶標(biāo)抗原，則C線處顯現(xiàn)條帶，T線處無條帶，T線條帶顏色深度與靶標(biāo)抗原含量成反比；C線不顯條帶則結(jié)果不能判斷。

競爭法分兩種模式，一種用于檢測抗原，另一種是當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去或不易得到足夠的純化抗原時，用來檢測特異性抗體。以膠體金標(biāo)記為例，在第一種檢測抗原的模式中，用膠體金標(biāo)記一定量的靶標(biāo)抗原并固定在結(jié)合墊上，T線與C線分別噴涂與靶標(biāo)抗原特異性結(jié)合的抗體（一抗）以及抗種屬特異性IgG的“抗抗體”（俗稱二抗）：對于陰性樣品，金標(biāo)抗原隨樣品側(cè)向流動，在T線處與一抗結(jié)合，在C線處與二抗結(jié)合，結(jié)果T線和C線均顯現(xiàn)紅色；對于陽性樣品，樣品中未被標(biāo)記的靶標(biāo)抗原和結(jié)合墊上金標(biāo)的靶標(biāo)抗原通過競爭與T線處的一抗結(jié)合，樣品中的靶標(biāo)抗原越多，結(jié)合在T線上的金標(biāo)抗原越少，顯色也就越淺，而過量的金標(biāo)抗原與C線處的二抗結(jié)合，故只有C線顯現(xiàn)紅色（圖3）。

圖 3 競爭法LFCA原理圖（模式一）Fig. 3 Schematic diagram for the principle of competitive LFCA (mode 1)

圖 4 競爭法LFCA原理圖（模式二）Fig. 4 Schematic diagram for the principle of competitive LFCA (mode 2)

在第二種檢測抗體的模式中，將抗體用膠體金標(biāo)記在結(jié)合墊上，T線和C線分別包含抗原與載體分子（通常為牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA））的結(jié)合物以及抗種屬特異性IgG的“抗抗體”（俗稱二抗）。樣品中的靶標(biāo)抗體和結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體共同競爭T線上的抗原與載體分子的結(jié)合物：對于陰性樣品，結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體分別與T線和C線上的固定物反應(yīng)結(jié)合，使T線和C線均顯現(xiàn)紅色；對于陽性樣品，樣品中的靶標(biāo)抗體會優(yōu)先和T線上的抗原與載體分子的結(jié)合物特異性結(jié)合，樣品中的靶標(biāo)抗體越多，結(jié)合在T線上的金標(biāo)抗體就越少，顯色也越淺，而過量的金標(biāo)抗體與C線處的二抗結(jié)合，故只有在C線處顯現(xiàn)紅色（圖4）[6,11-12]。

1.3 基于核酸的LFCA

由于親和素和生物素間特異性強(qiáng)、親和力大、可分別結(jié)合各種大小分子而構(gòu)成親和素-生物素系統(tǒng)（avidinbiotin system，ABS），將核酸和LFCA結(jié)合起來。類似ABS，生物素-生物素抗體、生物素-鏈霉親和素、熒光素-熒光素抗體、地高辛-地高辛抗體等系統(tǒng)也具有這種橋梁連接作用?；诖耍パa(bǔ)的核苷酸序列（DNA與DNA、DNA與RNA、RNA與RNA等）通過Watson-Crick堿基配對形成非共價鍵，從而形成穩(wěn)定的同源或異源雙鏈分子的核酸雜交過程，核酸也可被用作LFCA的生物識別元件。檢測結(jié)果及分析如下：T線和C線均顯條帶者為陽性樣品；C線顯色而T線不顯色者為陰性樣品；C線不顯色則結(jié)果不能判斷。依據(jù)方法過程中是否需要抗體，基于核酸的LFCA中分為兩種類型，一種是抗體依賴型（又稱“核酸側(cè)流免疫（nucleic acid lateral flow immunoassay，NALFIA）”），另一種是抗體非依賴型（又稱“核酸側(cè)流檢測試紙條（nucleic acid lateral test strips，NALTS）”）。

1.3.1 NALFIA技術(shù)

抗體依賴型LFCA中運(yùn)用了核酸-抗體相互作用以及雙鏈DNA的特異性標(biāo)記，因此又被稱為NALFIA。NALFIA其實(shí)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)與ELISA技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用。

以膠體金NALFIA為例：首先針對檢測靶標(biāo)特異性基因片段設(shè)計一對相應(yīng)的PCR引物，并對其進(jìn)行兩種不同標(biāo)記物標(biāo)記（如用生物素標(biāo)記一條引物，而用熒光素標(biāo)記另一條引物），通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生雙標(biāo)記的雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物；制作試紙條，在結(jié)合墊上固定一定量能與擴(kuò)增子標(biāo)記物之一特異性結(jié)合的物質(zhì)（如鏈霉親和素或親和素）和膠體金的復(fù)合物，T線噴涂特異性抗擴(kuò)增子另一標(biāo)記物的抗體的標(biāo)記物（如熒光素抗體），C線噴涂能與結(jié)合墊上復(fù)合物特異性結(jié)合的物質(zhì)（如生物素）；用制作的膠體金試紙條對PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

對于陽性樣品，雙標(biāo)擴(kuò)增子由于毛細(xì)管作用力從樣品墊側(cè)流至結(jié)合墊，其上的生物素與結(jié)合墊上的鏈霉親和素或親和素特異性結(jié)合，復(fù)合物又側(cè)流至T線后，雙標(biāo)擴(kuò)增子上的熒光素與T線上的熒光素抗體特異性結(jié)合，結(jié)合墊上過量的鏈霉親和素或親和素又與C線上的生物素特異性結(jié)合，又因結(jié)合墊上鏈霉親和素或親和素被膠體金標(biāo)記，所以T線與C線同時顯紅色；對于陰性樣品，結(jié)合墊上的鏈霉親和素或親和素與C線上的生物素特異性結(jié)合，所以只有C線顯紅色；C線不顯色則結(jié)果不能判斷。

1.3.2 NALTS技術(shù)

抗體非依賴型LFCA因不依賴抗體而被稱作NALTS。與NALFIA不同的是，NALTS的被檢樣品是單鏈核苷酸而非雙鏈核苷酸，它的關(guān)鍵步驟是核酸雜交。核酸適配體是一小段經(jīng)體外篩選得到的人造短鏈單鏈寡核苷酸（RNA或DNA），它們能特異性識別并結(jié)合靶向核酸且易于合成，并且在標(biāo)記過程中不會失去活性，因此，核酸適配體常被用在NALTS中代替抗體發(fā)揮作用[13]。以膠體金NALTS為例，結(jié)合墊上固定一定量被膠體金標(biāo)記的捕獲探針與標(biāo)記物（如生物素）的結(jié)合物，T線噴涂結(jié)合探針或其與BSA的結(jié)合物，C線噴涂與結(jié)合墊標(biāo)記物特異性結(jié)合的標(biāo)記物（如鏈霉親和素）。

對于陽性樣品，單鏈擴(kuò)增子與結(jié)合墊上的捕獲核酸探針雜交，復(fù)合物又與T線上的結(jié)合探針雜交，C線上的鏈霉親和素與結(jié)合墊上過量的生物素特異性結(jié)合，又因結(jié)合墊上捕獲探針與生物素被膠體金標(biāo)記，所以T線和C線同時顯紅色條帶；對于陰性樣品，C線上的鏈霉親和素與結(jié)合墊上的親和素特異性結(jié)合，所以只有C線顯紅色條帶；C線不顯色則結(jié)果不能判斷。

NALFIA和NALTS因檢測原理不同，檢測靈敏度和時間也有所不同。因為雜交過程比標(biāo)記物之間的親和反應(yīng)更耗費(fèi)時間，所以NALTS需要的檢測時間比NALFIA長；而靈敏度則與更多條件有關(guān)，無法給出統(tǒng)一結(jié)論。例如，赭曲霉毒素A是曲霉和青霉家族的次級代謝產(chǎn)物，它是一種小分子，適用于競爭性LFCA?；谶m配子[14]和抗體[15]的LFCA可用于赭曲霉毒素A的檢測?；贜ALTS的檢測限可達(dá)0.18 ng/mL[14]，基于NALFIA的檢測限為0.5 ng/mL[15]。

2 LFCA的影響因素

2.1 抗體

LFCA的靈敏度和特異性是基于免疫反應(yīng)物的選擇。綜上所述，LFCA對抗體種類和質(zhì)量都要求極高，所選抗體必須具有高親和力、敏感性和特異性，且在LFCA中往往需要一組配對的抗體（標(biāo)記抗體和T線抗體），提高了對抗體的要求及開發(fā)LFCA的難度。針對此問題，2016年Song Chunmei等[16]首次發(fā)明了只用一種抗體對食源性致病菌進(jìn)行半定量免疫熒光試紙檢測技術(shù)，實(shí)際樣品中大腸桿菌O157∶H7的檢測時間為5～10 min。

2.2 NC膜

影響LFCA檢測限的另一個關(guān)鍵因素是NC膜的選擇，不同孔徑的膜對檢測限和檢測時間影響不同。Laura[17]和Majdinasab[18]等使用Hi-Flow 180和Millipore NC膜，檢測限分別是1.5 ng/mL和0.25 ng/mL，檢測時間分別是20 min和15 min。

2.3 標(biāo)記材料

標(biāo)記材料同時承擔(dān)LFCA檢測結(jié)果的“可視化”和“抗體標(biāo)記”兩大功能，對該方法的靈敏度、檢測限等性能至關(guān)重要。納米金顆粒具有穩(wěn)定性高、抗體相容性好、顯色清晰等優(yōu)點(diǎn)，是LFCA最常用的抗體標(biāo)記材料。近年來，碳納米材料、量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換熒光材料、超順磁性納米顆粒等新型標(biāo)記材料的研究取得了突破性的進(jìn)展，使檢測性能大幅度提升。2015年Wang Chunying等[19]利用多色量子點(diǎn)標(biāo)記抗體，同時對甲胎蛋白和癌胚蛋白進(jìn)行雙靶標(biāo)檢測，檢測限分別可達(dá)3 ng/mL和2 ng/mL，并可在15 min內(nèi)得到檢測結(jié)果，其靈敏度高于ELISA方法。

3 LFCA研究進(jìn)展及應(yīng)用

LFCA中，標(biāo)記物是影響其靈敏度的關(guān)鍵因素之一。對抗體或抗原進(jìn)行標(biāo)記，通過標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)顯示反應(yīng)系統(tǒng)對應(yīng)的抗原或抗體的相對含量。

3.1 LFCA的標(biāo)記材料

根據(jù)標(biāo)記原理可分為兩大類：一類是以酶促反應(yīng)為基礎(chǔ)的酶標(biāo)記法；另一類是自顯色標(biāo)記法。對于不需要儀器輔助的免疫層析試紙，主要是自顯色標(biāo)記[7]。為增加試紙的靈敏性，人們一直在不斷尋找新型的標(biāo)記物，包括納米顆粒（金納米顆粒、碳納米顆粒）、發(fā)光納米顆粒（量子點(diǎn)、熒光猝滅材料、上轉(zhuǎn)換熒光材料）、超順磁納米顆粒、脂質(zhì)體和酶等標(biāo)記物，目前應(yīng)用最廣泛的是膠體金標(biāo)記[20]。

3.1.1 納米顆粒

納米顆粒因其特有的光學(xué)性質(zhì)（包括由組件和聚集產(chǎn)生的熒光或顏色變化）而被用作LFCA的示蹤劑[21]。目前，膠體金、銀和碳納米顆粒、碳納米管已被廣泛應(yīng)用于開發(fā)LFCA[22]。

3.1.1.1 膠體金

膠體金易于制備、成本低，可視化顏色形成較快，在液態(tài)或是干燥狀態(tài)下非常穩(wěn)定，不易褪色，廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域。但是，膠體金的形狀、大小、均一性和穩(wěn)定性是影響膠體金試紙條成功與否的關(guān)鍵因素。膠體金的顏色、大小與還原金的檸檬酸三鈉數(shù)量密切相關(guān)[23]。同時，膠體金的標(biāo)記還受多種因素的影響，如配體和膠體金的酸堿度以及膠體金和配體蛋白的比例等[24]。

3.1.1.2 碳納米管和碳納米顆粒

碳納米顆粒因其表面積大、光電特性良好而被應(yīng)用于側(cè)流免疫層析技術(shù)（lateral flow immunochromatographic assay，LFICA）分析中，其顏色比膠體金深，非常適合做標(biāo)記材料，而且成本低、易制備、綴合穩(wěn)定[25]。然而，碳納米顆粒的標(biāo)記效果會受反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度等條件影響[26]，碳納米顆粒的廣泛應(yīng)用還會給環(huán)境和人類健康帶來不利影響[27]。

3.1.1.3 其他納米材料

其他用于LFCA的納米材料有Fe3O4@Si納米顆粒[28]、硅原子納米顆粒[29]、乳膠微球[30]、鉑納米顆粒[31]等。其中，乳膠微球因其來源廣泛且價格低被廣泛應(yīng)用，其可通過氨基、羰基和巰基產(chǎn)生的簡單吸附和共價連接與很多物質(zhì)偶聯(lián)，其操作簡便、穩(wěn)定可靠、靈敏度高，但是需加碳二亞胺/N-羥基丁二酰亞胺活化乳膠微球中的反應(yīng)基團(tuán)才能有效標(biāo)記結(jié)合抗體或抗原。

3.1.2 熒光納米顆粒

最近許多研究表明，使用熒光納米顆粒比使用比色標(biāo)記材料獲得的檢測限更低[32]。熒光納米顆粒背景信號低、干擾少、靈敏度高、熒光素價格低廉，表面不需要修飾即可直接偶聯(lián)生物特異性抗體。然而其熒光信號不穩(wěn)定、容易猝滅，而且半定量分析的精確度欠佳。

3.1.2.1 量子點(diǎn)

擁有窄發(fā)射光譜、寬激發(fā)范圍和高熒光量子產(chǎn)率的量子點(diǎn)[33]，具有優(yōu)異的亮度、尺寸可調(diào)的熒光發(fā)射、較大的吸收系數(shù)、良好的穩(wěn)定性和高信噪比，已廣泛用于提高LFCA檢測靈敏度。然而，量子點(diǎn)標(biāo)記能誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生，因此對生物活性物質(zhì)具有一定毒性，不過這些毒性可以通過偶聯(lián)到蛋白質(zhì)分子上或者是覆蓋一層低毒物質(zhì)來降低。量子點(diǎn)和某些蛋白質(zhì)結(jié)合后可能導(dǎo)致量子點(diǎn)的熒光減弱或猝滅，如銅/鋅-超氧化物歧化酶對CdSe量子點(diǎn)的熒光有明顯的猝滅作用。另外，如果量子點(diǎn)標(biāo)記用于試紙的制備，其使用過程中需要紫外光源用于色澤變化的觀察，與肉眼觀察即可判斷檢測結(jié)果的其他類型試紙相比操作程序稍顯復(fù)雜。

3.1.2.2 熒光猝滅材料

熒光猝滅材料（有機(jī)熒光染料、熒光蛋白、膠體金和量子點(diǎn)等）已經(jīng)被用來檢測小的分析物，并且有研究發(fā)現(xiàn)信號強(qiáng)度和分析物的濃度呈正相關(guān)[32]。這些材料具有背景信號低、靈敏度高、可以標(biāo)記多個生物識別元件的優(yōu)點(diǎn)。

3.1.2.3 鑭系元素

已經(jīng)用于標(biāo)記LFCA以提高其檢測限的鑭系元素螯合物有Eu3+、Tb3+、Sm3+和Dy3+，它們作為標(biāo)記材料的原理是熒光反應(yīng)，因其納米顆粒與膠體金的尺寸相當(dāng)接近并且消除了背景熒光而被選為LFCA的標(biāo)記材料。與常規(guī)的熒光標(biāo)記和量子點(diǎn)相比，它們具有獨(dú)特且有應(yīng)用優(yōu)勢的熒光特性，例如熒光壽命長、發(fā)射光譜窄、斯托克斯位移大、光穩(wěn)定性突出等。

3.1.2.4 上轉(zhuǎn)換熒光體

上轉(zhuǎn)換熒光體是一種含鑭系元素的亞微米尺寸的陶瓷顆粒，其特殊的組成和結(jié)構(gòu)具備了優(yōu)良的光學(xué)特性，當(dāng)被紅外光激發(fā)時，它可以發(fā)射可見光。與其他熒光標(biāo)記相比，它的主要優(yōu)點(diǎn)有靈敏度高、保質(zhì)期長、永久記錄（無褪色）、基質(zhì)干擾低、成本低等。

3.1.2.5 其他熒光材料

研究者常用熒光信號來增強(qiáng)檢測信號以提高LFCA的靈敏度。熒光微球（fluorescent microspheres，F(xiàn)M）具有穩(wěn)定的構(gòu)型和高熒光強(qiáng)度，是多彩和安全的標(biāo)記材料。由于膠體金應(yīng)用時缺乏靈敏度，F(xiàn)M主要用于檢測幾種化合物，如黃曲霉毒素M1[34]、腫瘤壞死因子α[35]等。

3.1.3 超順磁納米顆粒

超順磁納米顆粒因其穩(wěn)定的磁信號而被裝置完全捕獲，可使檢測的靈敏度提高10～100 倍，使檢測時間縮短。然而它會產(chǎn)生背景噪聲，由于利用磁微粒標(biāo)記建立的快速檢測技術(shù)需要使用外界磁場，因此與膠體金標(biāo)記相比較為麻煩。另外，磁微粒具有較大的表面自由能和強(qiáng)磁偶極矩相互作用，彼此間易聚集，如果包被不良也會影響試紙的檢測結(jié)果。

3.1.4 酶

酶與底物反應(yīng)形成的顏色可以通過肉眼和標(biāo)準(zhǔn)的顏色圖表比色，直觀反應(yīng)檢測物的有無。但其分析靈敏度不高，且比色時可能會帶來由于人為錯誤判斷引起的不精確性。另外，酶是一種生物活性物質(zhì)，如果保存不當(dāng)，催化性能就會喪失。

3.1.5 脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是由一個或多個磷脂雙層組成的球形人工小泡，因其具有捕獲高濃度信號分子的能力，脂質(zhì)體診斷裝置可以把可視免疫層析的靈敏度提高2～3 個數(shù)量級。但其穩(wěn)定性低、操作復(fù)雜，因此應(yīng)用較少。

3.2 基于核酸LFCA的標(biāo)記材料

基于核酸LFCA的標(biāo)記原理是堿基配對，將帶有標(biāo)記物的已知序列的核酸片段和與其互補(bǔ)的核酸序列雜交形成雙鏈，用以檢測未知樣品中是否具有與其相同的序列，并能進(jìn)一步判定其與已知序列的同源程度。根據(jù)標(biāo)記材料是否具有放射性可分為放射性標(biāo)記材料和非放射性標(biāo)記材料。

3.2.1 放射性標(biāo)記材料

放射性同位素被用作標(biāo)記物，常用的有32P、3H、35S。放射性標(biāo)記材料的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，缺點(diǎn)是易造成放射性污染，同位素半衰期短、對人體有傷害。

3.2.2 非放射性標(biāo)記材料

生物素和地高辛被用作非放射性標(biāo)記材料，二者都是半抗原。生物素一親和素系統(tǒng)是一種具有親和力高、靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)的信號放大標(biāo)記技術(shù)[36]。生物素標(biāo)記對身體無害，但受到紫外線的照射后易發(fā)生分解。地高辛標(biāo)記與放射性同位素標(biāo)記探針的靈敏度相當(dāng)，并且特異性優(yōu)于生物素標(biāo)記[37]。

3.3 LFCA的應(yīng)用現(xiàn)狀

20世紀(jì)90年代開始，層析試紙技術(shù)以其價格低廉、方便攜帶使用、不需要專業(yè)人員、支持現(xiàn)場快速檢驗以及結(jié)果肉眼可見等優(yōu)勢，在人類、動物、植物醫(yī)學(xué)臨床檢測以及環(huán)境監(jiān)測、食品安全檢測等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

3.3.1 LFCA在人類醫(yī)學(xué)及動、植物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用

在LFCA建立并發(fā)展的早期，人們就將研究的目的放在了其在人類疾病診斷、預(yù)警、生理生化指標(biāo)的分析上。后來，隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)和種植業(yè)的不斷發(fā)展，動植物疫病對其危害也不斷加劇。迄今為止，有大量試紙已經(jīng)成功應(yīng)用于人類腫瘤性疾病、病毒性感染、細(xì)菌性傳染、動、植物性病毒病、細(xì)菌病、寄生蟲病等的快速檢測上。

表 1 LFCA在人類醫(yī)學(xué)及動、植物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用Table 1 Application of LFCA in the fields of clinical medicine, and animal and plant medicine

由表1可見，目前LFCA在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用甚廣，涉及人類、動物和植物，且以膠體金標(biāo)記雙抗夾心法為主，其檢測靈敏度可達(dá)ng/mL級，分析時間均在1 h之內(nèi)。由于膠體金易于制備、成本低、顏色形成較快、不易褪色，加上醫(yī)學(xué)領(lǐng)域檢測靶標(biāo)抗原大都是大分子物質(zhì)，含有較多的抗原位點(diǎn)，使膠體金標(biāo)記雙抗夾心法被高度的應(yīng)用在人類醫(yī)學(xué)及動、植物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，為醫(yī)學(xué)發(fā)展作出了巨大貢獻(xiàn)。膠體金作為層析試紙標(biāo)記材料由來已久、應(yīng)用甚多，更多更高效的標(biāo)記材料及方法值得研究者繼續(xù)并深入研究以取得更大成就。

3.3.2 LFCA在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用

目前，“從農(nóng)田到餐桌”的食品安全問題日益復(fù)雜化，食品安全問題頻發(fā)。病原微生物造成人體食物中毒，農(nóng)獸藥濫用處于無序狀態(tài)，重金屬超標(biāo)構(gòu)成糧食產(chǎn)品安全隱患，違法添加、摻雜摻假現(xiàn)象報道此起彼伏，食品安全已經(jīng)成為困擾人民健康生活的大問題。為響應(yīng)人民的需求，方便快速、低成本、節(jié)省時間、結(jié)果肉眼可見的LFCA已在包括食源性致病菌、農(nóng)獸藥殘留、違禁添加劑、生物毒素、重金屬離子檢測等領(lǐng)域被越來越多的應(yīng)用[47]。

表 2 LFCA在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用Table 2 Application of LFCA in the field of food safety

由表2可見，現(xiàn)階段LFCA在食品安全領(lǐng)域應(yīng)用甚廣，主要應(yīng)用于食源性致病菌和農(nóng)獸藥殘留檢測兩大方面。對微生物檢測主要以雙抗夾心法為主，而在農(nóng)獸藥殘留檢測領(lǐng)域大都采用競爭法。這些方法中膠體金作為標(biāo)記材料的應(yīng)用非常廣泛，為了提高靈敏度，近年來對一些新型標(biāo)記材料的應(yīng)用也有很多研究，比如量子點(diǎn)、磁性納米顆粒、上轉(zhuǎn)換熒光材料等。LFCA法對微生物的檢測限高達(dá)10～108CFU/mL，農(nóng)獸藥殘留的檢測限高達(dá)30 ng/mL～0.1 mg/L，檢測時間縮短至1～20 min。

3.3.3 LFCA在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的應(yīng)用

伴隨社會生產(chǎn)力發(fā)展而來的環(huán)境污染和破壞問題已經(jīng)成為威脅人類生存和發(fā)展的重大世界性問題，對此各國環(huán)保委員會發(fā)起環(huán)保聯(lián)合聲明，表示環(huán)境污染物的監(jiān)測為環(huán)保的首要環(huán)節(jié)。LFCA以其快速、可現(xiàn)場檢測等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用在環(huán)境監(jiān)測中。

表 3 LFCA在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的應(yīng)用Table 3 Application of LFCA in the field of environmental monitoring

由表3可見，現(xiàn)階段LFCA在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域應(yīng)用范圍廣但不全面，原因可能有二：其一，環(huán)境問題在以前并不嚴(yán)重，后來也并未得到真正重視；其二，環(huán)境監(jiān)測層析試紙開發(fā)困難較大、環(huán)境樣品不易收集處理等。目前應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測的LFCA試紙條靈敏度可達(dá)ng/mL數(shù)量級，檢測時間短至10 min左右。LFCA可被應(yīng)用在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域，為環(huán)境中水、空氣、土壤等污染的監(jiān)督管理工作提供便利。但對其他環(huán)境污染物的檢測開發(fā)還需進(jìn)一步研究和探索，以完善對其的監(jiān)督和管理。

4 LFCA與其他分析技術(shù)的比較

LFCA不需要專業(yè)操作人員和昂貴的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)對抗原、抗體和半抗原等各種分析物的定性和半定量檢測，在勞動力稀缺的地區(qū)起著重要作用，還可在短時間內(nèi)對幾種化合物進(jìn)行同時檢測。圖5對LFCA試紙檢測技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)。

圖 5 LFCA試紙條的優(yōu)缺點(diǎn)[24]Fig. 5 Advantages and disadvantages of LFCA test strip[24]

4.1 LFCA與傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測方法的比較

傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測方法中樣品需要經(jīng)增菌、分離培養(yǎng)和生化鑒定等步驟，完成一次檢測一般需要5～8 d。相比之下，LFCA除增菌外僅需幾十分鐘甚至幾分鐘的檢測時間，檢測快捷、靈敏度更高[68]。

4.2 LFCA與儀器分析化學(xué)技術(shù)的比較

目前，在檢測農(nóng)、獸藥以及重金屬殘留方面應(yīng)用較廣的是色譜法和質(zhì)譜法等相關(guān)檢測方法，其中色譜法又包括氣相色譜法、高效液相色譜法，高效液相色譜技術(shù)更為先進(jìn)。同時，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將氣相色譜儀與質(zhì)譜儀通過適當(dāng)?shù)慕涌谙嘟Y(jié)合，借助計算機(jī)技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用分析，發(fā)展成熟，成為復(fù)雜組分分離和鑒定的有效方法。表4從樣品前處理、靈敏度、檢測周期、成本和檢測要求5 方面以質(zhì)譜法和高效液相色譜法作為代表與LFCA作比較分析。分析表明，LFCA相較儀器分析化學(xué)技術(shù)，雖然檢測靈敏度低且不能進(jìn)行定量分析，但其所需成本低、對技術(shù)人員要求不高、檢測時間短。因此，可以用LFCA法作為一種初篩手段，對陽性結(jié)果進(jìn)一步使用儀器分析法得到準(zhǔn)確數(shù)值。也可通過借助一些數(shù)據(jù)讀取設(shè)備對LFCA法進(jìn)行半定量分析。

表 4 LFCA、質(zhì)譜法、高效液相色譜法對比Table 4 Comparison of mass spectrometry, high performance liquid chromatography and LFCA

4.3 LFICA技術(shù)與其他免疫學(xué)檢測技術(shù)的對比

表 5 LFICA與其他免疫學(xué)檢測技術(shù)的對比Table 5 Comparison of LFCIA and other immunoassays

免疫學(xué)檢測技術(shù)是以抗原與抗體的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)建立的，不同的檢測物質(zhì)有其特異的抗原，并能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體?；诿庖呒夹g(shù)的檢測方法以目標(biāo)菌的表面抗原或分泌毒素等為檢測靶點(diǎn)，因此是一種可用于檢測細(xì)菌或芽孢的方法。這種方法已廣泛應(yīng)用于食品中致病菌的檢測，包括ELISA、免疫磁性分離技術(shù)、放射免疫分析技術(shù)、免疫熒光技術(shù)等。表5以這幾種方法為代表與LFICA作比較分析。分析表明，LFICA相較其他免疫學(xué)檢測手段，不需特定儀器或復(fù)雜技術(shù)手段輔助，節(jié)省成本，且對檢測環(huán)境要求不高，適合現(xiàn)場快速檢測。

4.4 LFCA試紙檢測技術(shù)與分子生物學(xué)檢測技術(shù)的對比

分子生物學(xué)檢驗技術(shù)是以核酸或蛋白質(zhì)為分析材料，通過分析基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)的變化和由此而導(dǎo)致的基因功能的改變，為疾病的研究和診斷提供更準(zhǔn)確、更科學(xué)的信息和依據(jù)的一門技術(shù)。分子生物學(xué)檢測技術(shù)包括PCR技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)、生物發(fā)光檢測法等。表6以這幾種方法為代表與LFCA作比較分析[68]。分析表明，LFCA與分子生物學(xué)檢測技術(shù)相比，不需特定儀器及專業(yè)操作人員，檢測時間短，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性。但該方法靈敏度偏低且不能實(shí)現(xiàn)定量檢測，是LFCA法的瓶頸問題，需要進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)。

表 6 LFCA與分子生物學(xué)檢測技術(shù)的對比Table 6 Comparison of molecular biology techniques and LFCA

5 結(jié) 語

本文不僅研究總結(jié)了LFCA的背景、組成、原理、標(biāo)記材料及其在人類醫(yī)學(xué)、動、植物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測和食品檢測幾方面的應(yīng)用現(xiàn)狀，還將LFCA與傳統(tǒng)檢測方法、儀器分析化學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)檢測方法、分子生物學(xué)分析方法進(jìn)行對比，總結(jié)其優(yōu)劣勢。

LFCA雖然不如儀器分析化學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)檢測方法、分子生物學(xué)分析方法等的靈敏度高，而且不能定量檢測，但因其成本低、易操作、快速、便攜、干擾少、穩(wěn)定、結(jié)果肉眼可見、無需專業(yè)人員，適于現(xiàn)場檢測，仍被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境各領(lǐng)域。

LFCA目前已成熟應(yīng)用在各領(lǐng)域的物質(zhì)檢測中，但其靈敏度偏低、結(jié)果不能定量以及對標(biāo)記材料和抗體的依賴性依然是該技術(shù)的瓶頸問題。如何解決以上問題，開發(fā)出一種基于LFCA基本原理，又無需納米顆粒等標(biāo)記材料的高靈敏度、高準(zhǔn)確性、高穩(wěn)定性的新型LFCA技術(shù)或許會成為未來LFCA研究的新突破。

2012年，Rohrman等[69]將LFCA與擴(kuò)增和樣品制備技術(shù)相結(jié)合，達(dá)到對人類免疫缺陷病毒病毒的定量檢測，彌補(bǔ)了LFCA只可定性或半定量的不足。2015年，Jung等[39]將新的基因檢測技術(shù)-LAMP技術(shù)和LFIAC試紙檢測技術(shù)相結(jié)合，對流感病毒進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示該技術(shù)可在40 min內(nèi)完成基因擴(kuò)增和LFICA檢測，且靈敏度達(dá)到10 拷貝，同時可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測。隨著材料科學(xué)、電化學(xué)、廣電科學(xué)、基因擴(kuò)增技術(shù)等的不斷發(fā)展及各學(xué)科的交叉融合，將會有更多的新型標(biāo)記材料、抗體、檢測模式以及新型便攜化、微型化、自動化的定性、定量檢測儀器出現(xiàn)，可用于彌補(bǔ)現(xiàn)有LFCA的缺陷，使其在醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境各領(lǐng)域中發(fā)揮作用，為人類工作生活做出更大的貢獻(xiàn)。

綜上所述，LFCA的優(yōu)勢眾多，但靈敏度和定量問題亟待解決，隨著科技發(fā)展，LFCA還有很大的發(fā)展空間，值得廣大研究者們?nèi)ヅμ剿魍诰颉?/p>