何海娟 楊燕青 戴勤學(xué)

［1.臺州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）恩澤醫(yī)院，浙江 臺州 318000；2.臺州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）浙江省臺州醫(yī)院，浙江 臺州 318000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000］

【目的】 觀察腺苷A1受體是否介導(dǎo)參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用。方法 60只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、參麥注射液組、參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組、溶劑對照組。采用雙側(cè)股動脈夾閉的方法建立大鼠肢體缺血再灌注損傷模型，對照組大鼠不夾閉股動脈，其他操作同造模大鼠。參麥注射液組大鼠在造模后即刻腹腔注射參麥注射液，模型組大鼠在造模后即刻腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液，參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組大鼠在造模前30 min腹腔注射腺苷A1受體拮抗劑，造模后即刻腹腔注射參麥注射液。溶劑對照組大鼠只在造模前30 min注射二甲亞砜。大鼠肢體缺血再灌注48 h后處死，觀察海馬組織的腦水含量，采用尼氏染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷情況，采用Western blot法觀察大鼠海馬組織中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)量。結(jié)果 與對照組比較，模型組大鼠的海馬組織腦水含量明顯增高 （P<0.05），Bcl-2/Bax比率明顯減小，海馬CA1區(qū)正常細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P<0.05）。與模型組比較，參麥注射液組大鼠海馬組織腦水含量明顯減少（P<0.05），海馬CA1區(qū)正常細(xì)胞數(shù)量明顯增多，Bcl-2/Bax比率明顯升高（P<0.05）。與參麥注射液組比較，參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組大鼠海馬組織腦水含量明顯增加，Bcl-2/Bax比率明顯降低，海馬CA1區(qū)正常細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P<0.05）。結(jié)論 參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷大鼠海馬組織具有保護(hù)作用；腺苷A1受體可能介導(dǎo)了參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷大鼠海馬組織的保護(hù)作用。

肢體缺血再灌注損傷在臨床上是一個常見的病理生理過程，比如肢體血管再通、斷肢再植等［1］。當(dāng)肢體血流恢復(fù)時，其不僅僅引起肢體骨骼肌缺血性損傷，還可以通過全身炎癥反應(yīng)影響到遠(yuǎn)端臟器的損傷，比如肺、腦、腎等重要器官損傷［2］。目前研究者的關(guān)注熱點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端臟器損傷的保護(hù)。有研究表明大鼠肢體發(fā)生缺血再灌注損傷時，可以引起海馬組織損傷，誘發(fā)大鼠認(rèn)知功能障礙［3］。腺苷A1受體是一種抑制型G蛋白偶聯(lián)受體，通過配體腺苷激活后可以減少釋放興奮性氨基酸，從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用［4］。參麥注射液是臨床常用的一種藥物，中醫(yī)理論認(rèn)為參麥注射液具有益氣養(yǎng)陰之功效，其有效成分為麥冬皂苷、人參皂苷、麥冬黃酮、麥冬多糖和人參多糖［5］。課題組前期研究表明參麥注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠具有神經(jīng)保護(hù)的作用［6］，也有研究表明參麥注射液能改善肢體缺血再灌注損傷過程的肺脂質(zhì)過氧化損傷，從而減少肺臟的損傷［7］，但是其具體的機(jī)制并沒有被完全闡明。因此，本研究探討腺苷A1受體是否介導(dǎo)了參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷大鼠海馬組織的保護(hù)作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性SPF級Sprague Dawley大鼠 60只，體質(zhì)量（220±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司提供，許可證號碼：SCXK（滬）2015-0035。于造模前72 h購買并飼養(yǎng)于SPF級動物房中。手術(shù)前1 d禁食，但不禁水。

1.2 試藥與儀器 參麥注射液（正大青春寶藥業(yè)有限司）；A1R拮抗劑腺苷受體阻斷劑（1，3-dipropyl-8-cyclopentylxanthine，DPCPX，批號：2016YE356678）、二甲基亞砜（DMSO，美國 Sigma公司，批號：2013YE246396）；Bcl-2抗體 （美國Bioworld Technology公司，批號：SY20134321）；Bax抗體（美國abcam 公司，批號：ab53154）；酶標(biāo)儀（DENLEY DRAGON Wellscan MK3，Thermo，芬蘭）；BX60 顯微鏡（Olympus）。

1.3 給藥方法 參麥注射液組大鼠在造模后即刻腹腔注射參麥注射液15 mL/kg［9］，模型組大鼠在造模后即刻腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。將腺苷A1受體拮抗劑用DMSO溶劑溶解成1 mg/mL，參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組大鼠在造模前30 min腹腔注射腺苷A1受體拮抗劑1 mg/kg，造模后即刻腹腔注射參麥注射液15 mL/kg。溶劑對照組大鼠僅在造模前30 min注射DMSO溶劑1 mL/kg。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 1）尼氏染色。每組取6只大鼠麻醉后處死，剪開胸腔，用4%多聚甲醛經(jīng)心臟進(jìn)行灌注，直至大鼠全身僵硬，取出腦組織，放置4%多聚甲醛溶液浸泡過夜后，按常規(guī)方法制備石蠟組織切片。將備好的組織切片用甲酚紫染色液（尼氏染色液）對切片進(jìn)行染色10 min，用蒸餾水沖洗干凈；在顯微鏡下用分化液進(jìn)行分化，直至背景色接近無色；酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。海馬CA1區(qū)錐體層正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)在400倍光鏡下計數(shù)。對照組大鼠海馬神經(jīng)元中的圓形神經(jīng)元認(rèn)為是正常細(xì)胞。2）腦水含量測定。大鼠麻醉后處死，斷頭，在冰面上取出雙側(cè)海馬組織，其中一側(cè)放入液氮中準(zhǔn)備進(jìn)行Western bolting檢測。另一側(cè)海馬組織用濾紙吸干，稱重并記錄濕重，后置于60℃恒溫箱48 h烤干稱干重，求得腦水含量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。3）Western bolting法檢測 Bcl-2/Bax比率。海馬組織總蛋白的提取采用細(xì)胞蛋白提取試劑盒（Thermo公司，美國），按照說明書的步驟操作。等量樣品經(jīng)聚偏二氟乙烯膜分離蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，轉(zhuǎn)移后的NC膜經(jīng)BSA孵育1 h，再封閉后，分別加入兔抗大鼠Bcl-2或Bax單克隆抗體 （Santa Cruz公司，美國），4℃孵育并過夜。室溫下?lián)u床沖洗，再孵育二抗（山羊抗兔），并化學(xué)發(fā)光，顯影、成像。β-actin作為內(nèi)參對照。應(yīng)用Alphaimager 2200凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白。蛋白表達(dá)水平用目的蛋白條帶光密度值與β-actin條帶光密度值的比值來表示。Bcl-2/Bax比率＝Bcl-2蛋白表達(dá)水平/Bax蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較均采用單因素方差分析，若方差不齊采用Tamhane檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較；若方差齊采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠海馬組織腦水含量比較 見表1。與空白對照組比較，模型組大鼠的海馬組織腦水含量明顯增高（P<0.05），與模型組比較，參麥注射液組大鼠海馬組織腦水含量明顯減少（P<0.05），與參麥注射液組比較，參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組大鼠海馬組織腦水含量明顯增加（P<0.05）。溶劑對照組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)比較 見表1，圖1。采用尼氏染色的方法標(biāo)記海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元?？梢娔Ｐ徒M大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞體明顯縮小，胞漿內(nèi)尼氏體少而小，呈顆粒狀，細(xì)胞周圍出現(xiàn)水腫裂隙。參麥注射液組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷程度較模型組大鼠明顯好轉(zhuǎn)。參麥注射液+腺苷A1受體A1拮抗劑組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷程度較參麥注射液組大鼠嚴(yán)重。與空白對照組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)明顯減少（P<0.05），與模型組比較，參麥注射液組大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)明顯增多（P<0.05），與參麥注射液組比較，參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)明顯減少（P<0.05）。溶劑對照組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 各組大鼠海馬組織Bcl-2/Bax比率比較 見表1，圖2。與空白對照組比較，模型組大鼠海馬組織Bcl-2/Bax比率明顯減?。≒<0.05），與模型組比較，參麥注射液組大鼠海馬組織Bcl-2/Bax比率明顯增大（P<0.05），與參麥注射液組比較，參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組大鼠海馬組織Bcl-2/Bax比率明顯減?。≒<0.05）。溶劑對照組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠海馬組織腦水含量、正常神經(jīng)元計數(shù)、Bcl-2/Bax比率比較（±s）

表1 各組大鼠海馬組織腦水含量、正常神經(jīng)元計數(shù)、Bcl-2/Bax比率比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，與參麥注射液組比較，#P＜0.05

組 別 n Bcl-2/Bax比率海馬組織腦水含量（%）空白對照組 12 1.73±0.35模型組 12 0.67±0.25*參麥注射液組 12 2.27±0.79△正常神經(jīng)元計數(shù)（個/mm2）76.25±1.92 502±198 87.65±1.12* 329±129*79.36±2.13△ 467±157△參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組 12 1.32±0.57#83.97±1.59# 394±116#溶劑對照組 12 75.19±1.79 486±143 0.58±0.31

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)尼氏染色圖

圖2 各組大鼠海馬組織Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)量

3 討 論

肢體缺血再灌注損傷可以引起遠(yuǎn)端重要臟器損傷，從而誘發(fā)多器官功能障礙，最終導(dǎo)致死亡［10］。因此預(yù)防肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)的遠(yuǎn)端臟器損傷顯得十分重要。目前在臨床上，參麥注射液已經(jīng)廣泛運(yùn)用于圍手術(shù)期患者的器官保護(hù)［11］，但是其具體的機(jī)制并不明確。故本文以肢體缺血再灌注損傷大鼠為模型，以參麥注射液為干預(yù)手段，以大鼠海馬組織CA1組織形態(tài)學(xué)、腦水含量、Bcl-2/Bax比率為觀察指標(biāo)，以腺苷A1受體為研究切入點(diǎn)，從機(jī)制上闡明腺苷A1受體介導(dǎo)參麥注射液對大鼠肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)腦損傷的保護(hù)作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)肢體缺血再灌注損傷可以引起大鼠海馬組織CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)明顯較對照組減少，海馬組織腦水含量明顯高于對照組，Bcl-2/Bax比率明顯低于對照組，說明肢體缺血再灌注損傷確實(shí)可以誘發(fā)大鼠海馬組織的損傷，這與先前的研究結(jié)果相一致。參麥注射液注組大鼠海馬組織CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)明顯較模型組增多，海馬組織腦水含量明顯低于模型組，Bcl-2/Bax比率明顯高于模型組，說明參麥注射液可以緩解肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)的腦損傷。而參麥注射液+腺苷A1受體拮抗劑組大鼠的海馬組織腦水含量明顯較參麥注射液組增加，海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)明顯少于參麥注射液組，Bcl-2/Bax比率明顯低于參麥注射液組，說明腺苷A1受體拮抗劑能夠部分逆轉(zhuǎn)參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用。溶劑對照組與模型組比較，海馬組織CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)、海馬組織腦水含量和Bcl-2/Bax比率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明DMSO溶劑本身并不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。

有研究表明大鼠肢體缺血再灌注后腦組織中Bcl-2蛋白表達(dá)減少而Bax蛋白表達(dá)增加，我們的研究結(jié)果與其相一致。有研究認(rèn)為，Bcl-2和Bax蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞的程序性死亡，不但取決于自身表達(dá)量的高低，還與其兩者的比值相關(guān)。當(dāng)Bcl-2蛋白表達(dá)增加時，則抑制細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bax蛋白表達(dá)增加時，則加快細(xì)胞凋亡［12］。故本實(shí)驗(yàn)采用Bcl-2/Bax比率來評價海馬組織的損傷程度。

另有研究表明，參麥注射液可以增加腦組織中三磷酸腺苷（ATP）水平［6］，而 ATP 可以通過酶降解生成腺苷［13］。腺苷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)［13］。腺苷受體分為A1、A2a、A2b、A3受體，其中與腦保護(hù)最為密切相關(guān)的是腺苷A1受體［4］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，腺苷A1受體密集分布在海馬、小腦、上丘、皮質(zhì)中。已有大量的研究表明腺苷A1受體對腦缺血性損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制為抗炎、抗氧自由基形成、抗凋亡等［14］。因此，我們推測參麥注射液可以通過提高海馬組織中的腺苷水平，進(jìn)而激動腺苷A1受體達(dá)到腦保護(hù)的作用。

肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)遠(yuǎn)端臟器損傷的機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為炎癥反應(yīng)在此起了重要作用，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）在其中起了重要作用［15］。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)將會觀察海馬組織中的TNF-α和IL-1β，從更深一層機(jī)制中闡明參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用。

綜上所述，參麥注射液可以緩解大鼠肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)的海馬組織損傷，而腺苷A1受體拮抗劑能夠部分逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。因此，腺苷A1受體可能部分介導(dǎo)了參麥注射液對肢體缺血再灌注損傷大鼠海馬組織的保護(hù)作用。