王鳴 習東 周海荔 寧琴

肝細胞癌( hepatocellular carcinoma，HCC) 是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其血供豐富、生長迅速、惡性程度高、復發(fā)率及轉(zhuǎn)移率高，這些臨床特征使得HCC總體治療有限。近年來，探索針對肝癌的新型生物治療方法成為研究熱點，本研究所與公司合作，成功研發(fā)制備靶向人纖維介素蛋白(fibrinogen-like protein 2,fgl2)的微小RNA腺病毒注射液(Ad-hfgl2-miRNA)，本文旨在比較不同劑量Ad-hfgl2-miRNA對裸小鼠人肝癌皮下荷瘤生長的抑制作用，為進一步的肝癌靶向治療提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑 細胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清購自美國Gibco公司；DMSO(D2650)購自美國Sigma公司；臺盼藍染液(貨號G1019)購自武漢谷歌生物科技有限公司。

2.實驗動物 3～4周齡SPF級雄性balb/c-nu裸鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，體重20～22 g，飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心的SPF級實驗室，恒溫恒濕條件下供應高壓滅菌墊料、飼料、飲水。本部分試驗過程均需在無菌條件下執(zhí)行。

3.細胞 細胞系及病毒人肝癌高侵襲性細胞(HCCLM3)購自中科院上海細胞庫并由本研究所保存，在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。Ad-hfgl2-miRNA注射液由本研究所獨立開發(fā)制備。

二、裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型建立

收集T75 cm2培養(yǎng)瓶中處于對數(shù)生長期的HCCLM3細胞，按1×107/ml為目標濃度。選取裸鼠背部靠近前肢的皮下并避開血管密集部位為注射點，酒精棉球?qū)ζ溥M行消毒，將注射器中HCCLM3細胞搖勻，輕輕插入裸鼠背部皮膚，200 μl/只。術后每日觀察祼鼠狀態(tài)及皮下移植瘤生長情況，測量并記錄其最長直徑(a)，最短直徑(b)，計算腫瘤體積(腫瘤體積=1/2×a×b2)，待發(fā)現(xiàn)腫瘤顯著增大，腫瘤體積>100 mm3時，將荷瘤裸鼠隨機分組，分別為高劑量干預組(3.3×1010IU)、中劑量干預組(1.0×1010IU)、低劑量干預組(3.3×109IU)、陰性對照組。每組入組6只裸鼠。每組實驗重復3次。

三、實驗方法

瘤內(nèi)注射Ad-hfgl2-miRNA注射液在入組當天按設定劑量分別瘤內(nèi)多點注射3.3×1010、1.0×1010、3.3×109IU腺病毒注射液及非相關對照(Ad-neg-miRNA)，每6天干預1次，共干預4次，不同時間點觀察腫瘤大小變化，計算腫瘤體積、相對腫瘤體積和相對腫瘤增殖率。相關計算公式如下：相對腫瘤體積(RTV)=Vt/V0(V0為首次干預時腫瘤體積，Vt為干預后每個時間點所測量的腫瘤體積)；相對腫瘤增殖率(T/C)%=TRTV/CRTV×100%(TRTV：干預組的RTV，CRTV：非相關對照組的RTV)。原則上T/C%≤40%，并經(jīng)統(tǒng)計學處理P<0.05即為有效。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、不同時間點荷瘤裸鼠皮下移植瘤動態(tài)生長變化

分別于第1次干預后第1、3、5、7、10、13、16、19天測量腫瘤體積，各組腫瘤生長動態(tài)變化如圖1及表1所示，治療終點，即干預后第19天剝離腫瘤，大小及形態(tài)如圖2所示，自干預第10天時，高、中、低劑量干預組平均腫瘤體積均小于非相關對照組，第10天時腫瘤大小分別為(523.0±44.2)mm3、(543.2±16.5) mm3、(622.4±82.9) mm3、(1 042.0±138.8) mm3，各干預組與非相關對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此后每個測量時間點，各個干預組的平均腫瘤體積均小于對照組，至治療第19天，腫瘤體積分別為(307.2±22.3)mm3、(757.8±52.5) mm3、(1 042.0±50.1) mm3、(2 351.0±593.7) mm3，各干預組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義，同時干預劑量越高，腫瘤生長的抑制作用越明顯，表明Ad-hfgl2-miRNA注射液對肝癌生長有抑制作用，且抑制效果和劑量有一定依賴關系。

二、不同時間點各干預組荷瘤裸鼠的相對腫瘤體積

在干預后第10天、13天、16天、19天四個時間點，高、中劑量干預組的相對腫瘤體積均顯著小于非相關對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而低劑量干預組與非相關對照組相比則差異無統(tǒng)計學意義(圖3，表2)。

表1 各組不同時間點荷瘤裸鼠腫瘤體積大小±s,mm3)

圖1 荷瘤裸鼠皮下移植瘤動態(tài)生長變化

圖2 治療終點剝離的各組裸鼠皮下移植瘤

表2 各組不同劑量荷瘤裸鼠各時間點的相對腫瘤體積±s)

三、不同時間點荷瘤裸鼠皮下移植瘤的相對腫瘤增殖率

在干預后第16天，高、中、低劑量組相對腫瘤增殖率分別為28.37%、47.50%、57.65%，第19天時各組相對腫瘤增殖率分別為17.86%、44.50%、53.31%，其中從第16天開始，高劑量干預組的相對腫瘤增殖率均小于40%(表3)，干預效果顯著。

表3 各組不同時間點荷瘤裸鼠皮下移植瘤的相對腫瘤增殖率(%)

注：D3、5、7、10、13、16、19分別為第3天、5天、7天、10天、13天、16天、19天

圖3 不同時間點各干預組荷瘤裸鼠的相對腫瘤體積

討 論

HCC是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例超過 60萬例，是全世界第5常見的腫瘤，在男性中，其病死率繼肺癌之后已躍居第2[1]。每年約75 萬病人因HCC 死亡，在腫瘤相關性死亡中排第2 位[2]。超過80%的HCC發(fā)生在非西方國家，其主要危險因素有慢性病毒感染、酒精、鐵過量、黃曲霉素 B1、霉菌毒素、代謝因素等[3]。目前，基于HCC病人的全身狀況、肝功能、腫瘤大小及數(shù)目、血管侵犯、肝外轉(zhuǎn)移等因素考慮，針對肝癌的治療主要有手術切除、肝移植、消融術、化療栓塞、靶向治療等[4]，但總體治療效果欠佳。

生物治療作為HCC綜合治療的新模式已受到越來越多的重視，包括靶向治療、免疫治療、基因治療等。作為富血管腫瘤，HCC微環(huán)境中多個與血管新生信號通路相關的分子表達均上調(diào)，包括血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived endothelial cell growth factor,PDGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、fgl2等，這些分子與腫瘤血管新生密切相關，從而發(fā)揮促進腫瘤生長的作用[5]，阻斷促血管生成相關因子的表達在腫瘤抗血管新生治療方面具有潛在的應用前景。索拉非尼是目前唯一獲批用于肝癌的靶向藥物，其不僅能夠抑制RAF/MEK/ERK信號傳導通路直接抑制腫瘤生長，也可以通過抑制VEGF和PDGF受體阻斷腫瘤新生血管的形成，從而間接地抑制腫瘤細胞的生長，它還被認為是多種酪氨酸激酶受體抑制劑，能夠阻斷腫瘤的形成。一系列臨床試驗，包括Ⅲ期臨床試驗SHARP研究與ORIENTAL研究的分析結(jié)果，印證了索拉非尼治療HCC具有顯著療效[6-7]。目前，已有多達50余種類似藥物還在研究中，如Brivanib[8](針對VEGF及FGF)、Erlotinib[9](針對表皮細胞生長因子受體的拮抗劑)、PD-1抑制劑[10]等。

Fgl2已被證實在HCC等多種惡性腫瘤的實質(zhì)細胞、間質(zhì)浸潤細胞、血管內(nèi)皮細胞及細胞外基質(zhì)廣泛表達，并與纖維蛋白沉積有密切組織學關系[11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，fgl2基因敲除的高侵襲性人肝癌細胞系HCCLM6表達IL-8、VEGF的能力較對照組顯著下降，應用裸鼠角膜血管新生模型顯示fgl2基因沉寂后的人肝癌細胞誘導血管新生的能力顯著降低，證實了fgl2與腫瘤血管新生的密切關系，進一步研究發(fā)現(xiàn)，fgl2在腫瘤微環(huán)境中以凝血依賴的方式激活p38-MAPK和ERK途徑促進腫瘤細胞的增殖和血管新生[12]，此外，肝星狀細胞通過分泌可溶性fgl2，抑制腫瘤特異性CD8+T細胞的增殖，參與肝癌負性免疫微環(huán)境的形成，從而促進肝癌的發(fā)生發(fā)展[13]。體內(nèi)實驗也證實，fgl2基因沉默后裸鼠皮下移植瘤的生長受到顯著抑制，誘導血管新生的能力亦顯著降低[14]，表明敲除fgl2基因有望成為治療HCC的新策略。

隨著研究的不斷深入，基因治療已成為包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病新的治療模式?；蛑委煶Ｓ玫妮d體系統(tǒng)包括病毒載體和非病毒載體。與非病毒載體相比，腺病毒載體基因沉默持續(xù)時間更長，效果更好[15]，而與其他病毒載體如慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，腺病毒載體又具有不整合到宿主細胞基因組、高效感染宿主細胞、易于復制、易于操作、可感染分裂細胞也可感染靜止期細胞、安全性高等特點，因此，腺病毒載體在基因治療的研究中得到了廣泛應用[16-17]。RNA干擾技術(RNA interference,RNAi)是一種由內(nèi)源性或者外源性雙鏈DNA介導的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默技術[18],可通過miRNA和小干涉RNA(siRNA)來實現(xiàn)[19]，該技術目前已廣泛用于傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域[14,20-21]。本研究所采用miRNA技術及腺病毒載體系統(tǒng)成功構建靶向人fgl2的微小RNA腺病毒(Ad-hfgl2-miRNA)，以保證RNAi序列正確且高效轉(zhuǎn)入目的細胞并表達，結(jié)果表明，Ad-hfgl2-miRNA腺病毒注射液可顯著抑制裸鼠人肝癌皮下瘤生長，且干預效應和劑量有一定依賴關系，其中，高劑量干預組的相對腫瘤抑增殖率均小于40%，干預效果顯著，為探索肝癌基因治療提供了新的途徑。

盡管基因治療在導入基因如何高效持久表達、免疫性、倫理問題、載體的靶向性和基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的可控性等方面尚存在局限性，但只要我們堅持認真科學的態(tài)度,設計嚴謹?shù)呐R床研究方案，基因治療將很快在疾病治療的臨床選擇方案中占據(jù)一席之地。