徐超奕，張婷，蔡靜曉，余志良，裘娟萍，音建華

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音建華 博士，浙江工業(yè)大學生物工程學院副教授，碩士生導師。2013年于浙江大學微生物學專業(yè)獲博士學位；2013–2015年在浙江大學從事博士后研究。主要從事細菌耐藥機制及細胞壁合成調控機制研究，發(fā)現(xiàn)了一條獨特的β-內酰胺酶誘導表達通路，在和等國際主流期刊以第一作者發(fā)表研究論文7篇，主持國家自然科學基金青年項目，擔任浙江省微生物學會專業(yè)委員會青年委員。

革蘭氏陰性菌中β-內酰胺酶誘導表達調控機制研究進展

徐超奕，張婷，蔡靜曉，余志良，裘娟萍，音建華

浙江工業(yè)大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014

徐超奕, 張婷, 蔡靜曉, 等. 革蘭氏陰性菌中β-內酰胺酶誘導表達調控機制研究進展.生物工程學報, 2018, 34(8): 1288–1296.Xu CY, Zhang T, Cai JX, et al. Progress in regulatory mechanism for inducing β-lactamase in Gram-negative bacteria. Chin J Biotech, 2018, 34(8): 1288–1296.

β-內酰胺類抗生素是應用最廣的一類抗菌藥物。β-內酰胺酶能將β-內酰胺類抗生素水解，其誘導表達是革蘭氏陰性菌對該類抗生素產生耐藥性的最主要原因。文中重點綜述了革蘭氏陰性菌中β-內酰胺酶誘導表達的兩種調控機制。在經典的-調控系統(tǒng)中，β-內酰胺酶的誘導表達與肽聚糖循環(huán)密切相關，并且LysR型轉錄因子AmpR發(fā)揮核心的調控作用。近年來發(fā)現(xiàn)β-內酰胺類抗生素能激活雙組分系統(tǒng)，從而誘導β-內酰胺酶的表達。最后，討論了革蘭氏陰性菌中β-內酰胺類耐藥今后的研究方向。

革蘭氏陰性菌，β-內酰胺類抗生素，β-內酰胺酶，調控機制，雙組分系統(tǒng)

β-內酰胺類抗生素 (簡稱β-內酰胺類，β-lactams) 是臨床治療中應用最悠久且最廣泛的一類抗菌藥物。該類藥物的化學結構中都含有β-內酰胺環(huán)，包括青霉素類、頭孢菌素類、單環(huán)β-內酰胺類、碳青霉烯類和β-內酰胺酶抑制劑等[1]。青霉素結合蛋白 (Penicillin binding protein，PBP) 是細菌中重要的肽聚糖合成酶，負責肽聚糖糖鏈的聚合和鏈間的交聯(lián)。β-內酰胺類能與青霉素結合蛋白不可逆共價結合，從而阻斷肽聚糖的生物合成過程，致使細菌裂解死亡[2]。

近年來，由于抗生素的濫用和不合理使用導致細菌耐藥性問題日益凸顯。世界衛(wèi)生組織公布了一份亟待研發(fā)新抗生素的12種耐藥細菌清單，其中半數(shù)為β-內酰胺類耐藥細菌，尤其是優(yōu)先度最高的3種細菌均為耐碳青霉烯類的革蘭氏陰性桿菌[3]。細菌對β-內酰胺類產生耐藥的原因包括：一是修飾或改變抗生素的靶點，革蘭氏陽性菌多采用該機制產生耐藥性，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin resistant，MRSA) 對β-內酰胺類的抗性即來源于此；二是編碼β-內酰胺酶將抗生素水解，這是革蘭氏陰性菌中最為普遍的耐藥機制；三是減弱細胞外膜通透性，限制抗生素進入細胞內；四是提高藥物外排泵的表達，將進入細胞內的抗生素外排[4]。

β-內酰胺酶廣泛存在于各種臨床致病菌和環(huán)境微生物中，根據(jù)氨基酸序列一致性可分為A、B、C和D四種類型[5]。其中，A、C和D型均為絲氨酸β-內酰胺酶，而B型為金屬β-內酰胺酶。β-內酰胺酶的表達受β-內酰胺類誘導，但由于該類抗生素無法穿越細胞質膜，其如何誘導β-內酰胺酶的表達長期以來備受關注。目前研究最為深入的是部分革蘭氏陰性桿菌中C 型β-內酰胺酶AmpC誘導表達的調控，發(fā)現(xiàn)其與肽聚糖循環(huán)和LysR型轉錄因子AmpR密切相關。近年來，越來越多的研究表明雙組分系統(tǒng) (Two component system，TCS) 也能調控β-內酰胺酶的表達。本文將結合實驗室研究工作，綜述這兩種β-內酰胺酶誘導表達調控機制，以期為新型抗生素的研發(fā)提供新靶點和新思路。

1 經典的ampR-ampC調控系統(tǒng)

C型β-內酰胺酶AmpC (由基因編碼) 是一種頭孢菌素酶，能夠水解青霉素類、頭孢菌素類以及單環(huán)β-內酰胺類等抗生素[6-7]。AmpC的誘導表達是腸桿菌科細菌 (如陰溝腸桿菌和弗氏檸檬酸桿菌) 以及非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌 (如銅綠假單胞菌) 對β-內酰胺類產生耐藥性的主要原因。對這些細菌的研究表明，AmpC的誘導表達與肽聚糖循環(huán)密切相關，并且LysR型轉錄因子AmpR (由基因編碼) 起核心調控作用，這種機制被稱為經典的-調控系統(tǒng)[8-10]。

1.1 ampR-ampC divergon

在含有-調控系統(tǒng)的細菌中，與基因在染色體上相鄰排列，啟動子區(qū)域相互重疊，但轉錄方向相反，即形成divergon結構?；蚓幋aLysR型調控蛋白AmpR，是基因的轉錄激活因子。AmpR通常具有兩個結構域：效應物結合結構域和DNA結合結構域。效應物結合結構域能與不同的效應物或配體結合，從而改變DNA結合結構域的構象，通過與和基因間隔區(qū)序列結合，調控兩個基因的表達[11]。

1.2 肽聚糖循環(huán)過程

細菌在正常生長過程中，肽聚糖始終處于一種動態(tài)平衡。在幾十種肽聚糖合成酶和水解酶的共同作用下，不斷地進行更新和循環(huán)[12]。由于β-內酰胺類的靶點是青霉素結合蛋白，抗生素處理時將不可避免地破壞肽聚糖循環(huán)的平衡。與β-內酰胺酶誘導表達密切相關的肽聚糖循環(huán)酶系主要包括AmpG、AmpD和NagZ[12]。AmpG是位于細胞質膜上的一種通透酶，含有10個跨膜結構域，負責肽聚糖水解產物的轉運，如GlcNAc-anhMurNAc和GlcNAc-anhMurNAc-peptides等[13-14]。AmpD和NagZ均位于細胞質中，其中AmpD為N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶 (N-acetylmuramyl-L-Ala amidase)，能迅速水解anhMurNAc和L-Ala之間的酰胺鍵；而NagZ是β-乙酰氨基葡糖糖苷酶 (β-N-acetylglucosaminidase)，負責切開GlcNAc和anhMurNAc之間的β-1,4糖苷鍵[15]。AmpD和NagZ的共同作用可將細胞質中的肽聚糖水解產物進一步生成GlcNAc、anhMurNAc以及anhMurNAc-peptides (圖1)。

1.3 AmpG-AmpD-NagZ-AmpR調控通路

在缺乏β-內酰胺類誘導物時，由于AmpD和NagZ的作用使細胞內anhMurNac-peptides始終維持在較低的濃度，而三肽L-Ala-D-Glu--Dap含量較高，進一步催化后生成UDP-MurNAc- pentapeptide。UDP-MurNAc-pentapeptide可作為阻遏信號分子與AmpR結合，從而抑制基因的轉錄。當誘導物存在時，細胞周質空間中肽聚糖的損傷導致進入細胞質的肽聚糖水解產物大幅度增加，AmpD達到飽和狀態(tài)，anhMurNAc-peptides大量積累，并作為誘導信號分子與UDP-MurNAc- pentapeptide競爭結合AmpR，引起AmpR蛋白構象的變化，從而激活基因的轉錄 (圖1)[11]。

AmpG-AmpD-NagZ-AmpR調控通路中任一基因的突變都有可能影響基因的誘導表達?；虻娜笔ё钄嗔薬nhMurNac-peptides的水解，使得誘導信號分子始終處于高濃度，引起AmpC高表達，致使很多臨床菌株對β-內酰胺類產生耐藥性[16-17]。中共有3個AmpD同源蛋白，它們的依次失活能引起AmpC表達水平和細菌耐藥程度逐級增加[18-20]。AmpG的失活使誘導信號分子前體無法進入細胞質，導致基因的表達不再被誘導[21-22]。NagZ可催化誘導信號分子的產生，因此基因突變與效果一致，均能阻斷基因的表達。AmpG和NagZ的失活還能顯著降低因基因突變引起的AmpC高表達[23]。

圖1 AmpR介導的β-內酰胺酶誘導表達調控模式圖

這種經典的-調控系統(tǒng)同樣適用于目前所研究的其他類型β-內酰胺酶的誘導表達，如霍亂弧菌中B型β-內酰胺酶VanG[24]、野油菜黃單胞菌中A型β-內酰胺酶Blaxc[25-26]以及嗜麥芽窄食單胞菌中A型β-內酰胺酶L2 (BlaL2) 和B型β-內酰胺酶L1 (BlaL1)[27-29]。中基因和基因構成divergon，但AmpR可同時激活L1/L2的表達。此外，該菌中基因 (編碼PBP1a) 的失活致使這兩個β-內酰胺酶呈組成型高表達，并且該過程依賴于AmpG-AmpD-AmpR，但不依賴于NagZ，表明L1/L2的表達除了遵循經典的-調控系統(tǒng)外，還存在一條不依賴于NagZ的調控通路[30-33]。

1.4 肽聚糖水解酶對β-內酰胺酶表達的影響

正是由于肽聚糖循環(huán)與AmpC表達密切相關，細胞周質空間中肽聚糖的細微變化都有可能影響β-內酰胺酶的表達。目前已經發(fā)現(xiàn)部分肽聚糖水解酶與β-內酰胺酶的表達調控有關，如溶菌糖基轉移酶 (Lytic transglycosylases，LTs) 和低分子量PBP等。通常，這些肽聚糖水解酶在細菌中數(shù)量較多，并且功能冗余，它們對β-內酰胺酶表達的影響在不同細菌中存在差異。LTs能將GlcNAc和MurNAc之間的β-1,4糖苷鍵切開，釋放-調控系統(tǒng)中的誘導信號分子前體GlcNAc-1,6-anhMurNAc peptides。因此，LTs的失活勢必影響β-內酰胺酶的表達。中含有11個LTs，但只有SltB1和MltB的失活增強AmpC的表達，而SltB的失活降低AmpC的表達[34-35]。中含有6個LTs，MltD1的失活通過上調其他LTs (MltB1和MltD2) 的表達增強L1/L2本底水平的表達，該過程依賴于AmpG-AmpD-NagZ-AmpR通路以及雙組分系統(tǒng)CreBC[36]。低分子量PBP具有DD-羧肽酶和/或內肽酶活性，負責肽聚糖的修飾。中PBP4的突變使β-內酰胺酶AmpC以依賴于AmpR的方式過表達，顯著增強對β-內酰胺類的耐藥性[37-38]。

2 雙組分系統(tǒng)介導的β-內酰胺酶誘導表達

雙組分系統(tǒng)是微生物中廣泛存在的基因表達調控系統(tǒng)。該系統(tǒng)高度保守，一般由組氨酸激酶 (Histidine kinase) 和反應調節(jié)蛋白 (Response regulator) 二元組分構成。組氨酸激酶屬跨膜蛋白，其N末端能夠感知外界信號，催化C末端保守的組氨酸殘基自磷酸化；然后將磷酰基轉移至位于細胞內的反應調節(jié)蛋白，保守的天冬氨酸殘基發(fā)生磷酸化，從而激活或抑制基因的表達，使微生物適應不同的環(huán)境變化[39]。組氨酸激酶感知的信號多種多樣，如滲透壓、細胞膜損傷、細胞壁損傷、金屬離子和抗生素等；反應調節(jié)蛋白調控的生命過程也多種多樣，如維持穩(wěn)態(tài)、毒力響應、呼吸轉換以及抗生素耐藥等。

2.1 氣單胞菌中β-內酰胺酶表達的調控

氣單胞菌屬中的BlrAB是第一個被發(fā)現(xiàn)直接調控β-內酰胺酶表達的雙組分系統(tǒng)。屬細菌通常編碼三種可誘導型β-內酰胺酶：B型CphA (也稱Imi)、C型Cep和D型Amp[40-41]。對模式菌株嗜水氣單胞菌的研究發(fā)現(xiàn)，編碼雙組分系統(tǒng)的基因位于β-內酰胺酶基因的上游，其中編碼反應調控蛋白BlrA，而編碼組氨酸激酶BlrB。β-內酰胺類誘導物抑制PBP的活性，致使肽聚糖平衡紊亂，二糖五肽單元 (GlcNAc-MurNAc-pentapeptide) 含量增加，很有可能作為信號分子通過直接或間接作用使BlrB自磷酸化；隨后，磷酸基團轉移至BlrA，激活的BlrA與特異的識別標簽(cre/blr-tag：TTCACnnnnnnTTCAC) 結合，從而募集RNA聚合酶啟動β-內酰胺酶的表達[42](圖2)。三個β-內酰胺酶基因的上游均存在該特異標簽，并且標簽的重復次數(shù)與β-內酰胺酶的表達水平呈正相關。、和基因前的標簽數(shù)分別為1、2、3個，β-內酰胺酶的表達水平為ImiH>CepH>AmpH[41,43-44]。BlrB感知的信號源自于肽聚糖損傷，DD-羧肽酶/內肽酶 (PBP4和BlrY) 的失活顯著提高二糖五肽單元含量，增強β-內酰胺酶的表達 (圖2)；而萬古霉素能與D-Ala-D-Ala特異性結合，處理細菌后β-內酰胺酶的表達受到抑制。另外，基因下游含有一個編碼內膜蛋白的基因，其轉錄受BlrAB控制，但BlrD在β-內酰胺酶表達中的作用尚不清楚[44]。

圖2 雙組分系統(tǒng)介導的β-內酰胺酶表達調控示意圖

大腸桿菌中的雙組分系統(tǒng)CreBC與BlrAB高度同源，最初發(fā)現(xiàn)CreBC是中間代謝的全局調控因子[43,45]。反應調節(jié)蛋白CreB識別的特異序列與BlrA一致，當屬來源的3個β-內酰胺酶基因連同上游序列一起轉入DH5α菌株 (CreB+) 時，β-內酰胺酶可被成功表達[43]。

和中的CreBC可能參與β-內酰胺酶表達的調控。中PBP4的突變特異性激活CreBC，然后上調CreD (與BlrD同源) 的表達，間接參與β-內酰胺酶的表達[37,46]。此外，CreBC還在β-內酰胺類脅迫、生物膜形成以及細菌適應度方面發(fā)揮重要的作用[46]。中CreBC與細菌運動性密切相關[47]，MltD1失活導致的β-內酰胺酶表達同時需要CreBC和AmpR的參與[36]。

2.2 弧菌中β-內酰胺酶表達的調控

副溶血性弧菌是一種重要的食源性致病菌，其對青霉素類的耐藥性主要由A型β-內酰胺酶 (V100) 介導[48]。該菌中含有32個可能的雙組分系統(tǒng)，但只有VbrKR缺失后顯著降低β-內酰胺酶的表達和β-內酰胺類耐藥性。VbrK是一種能直接感知β-內酰胺類的組氨酸激酶，抗生素的結合使其空間構象發(fā)生變化，組氨酸激酶結構域與ATP酶結構域之間更加接近，隨后VbrK自磷酸化并將磷酸基團轉移至反應調節(jié)蛋白VbrR，從而觸發(fā)β-內酰胺酶的表達[49](圖2)。有趣的是，VbrKR還能調控PBP1a和PBP3的表達，但是否與β-內酰胺酶表達相關尚不清楚。

與BlrAB/CreBC明顯不同的是，VbrK感知的信號并非來自于肽聚糖的損傷，而是直接與抗生素結合，然后迅速將信號傳遞至細胞內，通過誘導β-內酰胺酶的表達保證在細胞裂解之前將抗生素水解[50]。VbrK是目前革蘭氏陰性菌中唯一發(fā)現(xiàn)能直接感知β-內酰胺類的受體蛋白。幾乎所有弧菌屬細菌都編碼與VbrK同源的組氨酸激酶，因此弧菌屬可能普遍存在VbrK介導的β-內酰胺酶表達調控機制。革蘭氏陽性菌中β-內酰胺酶 (如BlaP和BlaZ) 的誘導表達也起始于抗生素與膜受體蛋白之間的直接相互作用，但受體蛋白感知抗生素后自身變成有活性的金屬蛋白酶，通過水解阻遏蛋白誘導β-內酰胺酶的表達[51]。

2.3 希瓦氏菌中β-內酰胺酶表達的調控

水環(huán)境中廣泛存在的希瓦氏菌屬被認為是β-內酰胺類和喹諾酮類耐藥基因的天然存儲庫，部分菌株也逐漸成為新興致病菌[52-53]。該屬的模式菌株奧奈達希瓦氏菌編碼7個假定的β-內酰胺酶，其中由染色體介導的D型β-內酰胺酶BlaA (也稱為OXA-54) 可能是碳青霉烯類水解酶Oxacillinase的祖先[54]。筆者近年來的研究發(fā)現(xiàn)，該酶的表達受氨芐青霉素誘導，但具體的誘導機制與AmpR介導的調控系統(tǒng)差異顯著，主要表現(xiàn)在兩個方面：一是基因組中基因未與其他調控蛋白基因構成divergon，也不含有與AmpR高度同源的調控蛋白；二是主要的肽聚糖循環(huán)酶 (如AmpG、NagZ和AmpD) 對表達的影響與經典的-調控系統(tǒng)相反[55-57]。和基因缺失后基因的表達仍可被誘導，表明該菌中存在一條不依賴于AmpG-NagZ-AmpR的β-內酰胺酶誘導表達通路。該通路與PBP1a及其外膜脂蛋白輔因子LpoA有關，這兩個蛋白形成肽聚糖合成酶復合體PBP1a-LpoA，其失活導致基因呈組成型高表達，暗示誘導表達的信號分子位于周質空間。中含有數(shù)目眾多的雙組分系統(tǒng)，雖不與CreBC或VbrKR高度同源，但有證據(jù)表明其他雙組分系統(tǒng)參與表達的調控。PBP1a與周質空間中的β-內酰胺類共價結合而失活，致使細胞被膜受損，激活雙組分系統(tǒng)，從而誘導β-內酰胺酶的表達[58-60]。

3 結論與展望

由此可見，革蘭氏陰性菌中β-內酰胺酶誘導表達調控機制具有以下共同特點：LysR型轉錄因子或雙組分系統(tǒng)在調控中起核心作用；如果β-內酰胺酶基因與LysR型轉錄因子編碼基因組成divergon，那么該β-內酰胺酶的表達受LysR型轉錄因子調控；同一物種中可能同時包含兩種調控通路 (如和)，二者之間存在相互影響；肽聚糖循環(huán)在β-內酰胺酶誘導表達過程中發(fā)揮重要的作用，除VbrKR直接感知抗生素外，其他已經發(fā)現(xiàn)的調控蛋白均感知肽聚糖水解片段。

由于肽聚糖生物合成和循環(huán)過程非常復雜，目前我們對誘導β-內酰胺酶表達的信號分子仍不清晰，尤其是抗生素作用對肽聚糖的具體影響缺乏詳實數(shù)據(jù)。未來的研究應該從以下幾個方面展開：1) 繼續(xù)研究不同細菌中β-內酰胺酶誘導表達的調控機制，尤其是重要的臨床致病菌和環(huán)境微生物。CRISPR-Cas9基因編輯技術的發(fā)展使得這些細菌的遺傳改造變得方便快捷。2) 利用生物信息學工具，從數(shù)據(jù)庫中挖掘β-內酰胺酶誘導表達調控相關元件的分布規(guī)律，在進化層面上明確抗性基因的來源和轉移規(guī)律。3) 已有報道表明NagZ抑制劑能有效降低AmpC高產菌株對β-內酰胺類的耐藥性[23]，接下來應針對β-內酰胺酶誘導表達通路中的新靶點，加大篩選特異性藥物的力度，從而有效解決革蘭氏陰性菌中的β-內酰胺類耐藥問題。

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(本文責編 陳宏宇)

Progress in regulatory mechanism for inducing β-lactamase in Gram-negative bacteria

Chaoyi Xu, Ting Zhang, Jingxiao Cai, Zhiliang Yu, Juanping Qiu, and Jianhua Yin

College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, Zhejiang, China

Beta-lactams are the most widely used antibiotics. One of the principle mechanisms for Gram-negative bacteria to resist β-lactams is by producing β-lactamases that degrade β-lactams. This review highlights two regulatory mechanisms for inducing β-lactamase in Gram-negative bacteria. In the-paradigm, the induction of β-lactamase is intimately linked to peptidoglycan recycling. AmpR, a LysR-type transcriptional regulator, plays a central role in regulating expression of β-lactamase. Recent studies found that two-componentsignal transduction pathway is activated by β-lactams, which in turn induces the expression of β-lactamase. Finally, we discussed the future research directions in β-lactam resistance in Gram-negative bacteria.

Gram-negative bacteria, β-lactam antibiotics, β-lactamase, regulatory mechanism, two-component system

May 4, 2018;

June 11, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31600041).

Jianhua Yin. Tel/Fax: +86-571-88320057; E-mail: jianhuay@zjut.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 31600041) 資助。

2018-07-02

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180629.1800.001.html

10.13345/j.cjb.180187