徐旋，曲芬

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曲芬 解放軍第三〇二醫(yī)院臨床檢驗醫(yī)學中心主任醫(yī)師，教授。獨立承擔全軍“十二五”重點課題等共8項；以第一作者或通訊作者在國內(nèi)外期刊發(fā)表論文200余篇；主編副主編專著4部；獲軍隊科技成果一等獎1項，獲軍隊醫(yī)療成果獎二等獎4項、三等獎5項；中華預防醫(yī)學會科學技術(shù)成果二等獎1項。社會兼職包括解放軍第十屆醫(yī)學科學技術(shù)委員會檢驗醫(yī)學委員、中國藥學會抗生素專業(yè)委員會委員、中國研究型醫(yī)院學會檢驗醫(yī)學專業(yè)委員會委員等。

碳青霉烯耐藥的腸桿菌科細菌診斷進展

徐旋1,2，曲芬2

1 北京大學醫(yī)學部，北京 100083 2 解放軍第三〇二醫(yī)院 臨床檢驗醫(yī)學中心，北京 100039

徐旋, 曲芬. 碳青霉烯耐藥的腸桿菌科細菌診斷進展.生物工程學報, 2018, 34(8): 1338–1345.Xu X, Qu F. Progress in the diagnosis of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Chin J Biotech, 2018, 34(8): 1338–1345.

碳青霉烯耐藥的腸桿菌科細菌 (Carbapenem-resistant，CRE) 在全球快速上升，已出現(xiàn)了不同的基因型，為臨床診治提出新的挑戰(zhàn)。CRE分為具有不同特點和耐藥基因的三大類五大家族；診斷方法包括Kirby-Bauer法初篩試驗，碳青霉烯類藥物的協(xié)同試驗 (EDTA與美羅培南、苯硼酸與美羅培南的雙紙片抑制法)、改良的Hodge試驗、顯色培養(yǎng)基檢測等CRE篩選試驗，而Carba NP比色微管試驗、PCR及測序等為CRE確認試驗。上述方法均各有其優(yōu)缺點，可根據(jù)當?shù)氐闹饕餍蠧RE型別和實驗條件選擇應用。

碳青霉烯耐藥的腸桿菌科細菌 (CRE)，診斷，耐藥

美國疾病控制中心 (Center of diseases control，CDC) 定義碳青霉烯耐藥的腸桿菌科細菌(Carbapenem-resistant，CRE) 為腸桿菌科細菌對多利培南、厄他培南、美羅培南或亞胺培南不敏感，或者證實腸桿菌科細菌產(chǎn)生碳青霉烯酶[1]。其中腸桿菌科包括62個屬，常見引起人類感染的有10個屬，是重要的臨床感染病原菌[2]。碳青霉烯類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌活性強并對β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定以及毒性低等特點。隨著其廣泛應用，耐藥快速增長，其中CRE由于高度耐藥、傳播速度快、致死率高而備受關(guān)注，被世界衛(wèi)生組織 (World health organization，WHO) 列為全球耐藥的緊急威脅。WHO于2014年公布肺炎克雷伯菌的CRE產(chǎn)生率在歐洲、東南亞和地中海東部地區(qū)分別高達68%、55%和54%[3]；CRE在美國的發(fā)生率分別為：肺炎克雷伯菌11%，大腸埃希菌2%，相關(guān)死亡率高達40%–50%[4-5]；而中國的CRE的產(chǎn)生率在快速上升，最高地區(qū)達14.97%，總體病死率達33.5%[6]。入院攜帶CRE的患者直接增加住院期間的感染率及死亡率[7-9]；CRE的出現(xiàn)及種類的不斷增加，也造成嚴重的社會與經(jīng)濟負擔[10]，更為臨床診治提出新的挑戰(zhàn)。有效治療的前提是及時診斷。本文對CRE的特點及診斷方法作一綜述。

1 CRE的特點

CRE根據(jù)分子結(jié)構(gòu)分為A (A組絲氨酸酶)、B (B組金屬酶)、D (D組絲氨酸酶) 三大類，各類酶的種類及特點見表1。A組酶活性部位為絲氨酸，可被3-氨基苯硼酸抑制，常見基因型包括KPC、IMI、GES、NMC等；B組酶的活性部位為金屬鋅離子，可被EDTA抑制，常見基因型為VIM、IMP、GIM、NDM等；D組酶也為絲氨酸酶，主要基因型為OXA型[11]。

表1 CRE的種類與特點

AVB: avibactam; APBA: 3′-Aminophenylboronic acid; EDTA: ethylene diamine tetra-acetic acid; ATM: aztreonam; CLA: clavulanic acid.

2 CRE的診斷方法

目前CRE的篩選及診斷方法在不斷地發(fā)展與完善，從最簡單的Kirby-Bauer法 (K-B紙片擴散) 初篩試驗，到碳青霉烯類藥物的協(xié)同試驗 (乙二胺四乙酸 (Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA) 和美羅培南、苯硼酸與美羅培南的雙紙片抑制法)、改良Hodge試驗 (Modified Hodge test，MHT)、顯色培養(yǎng)基檢測等為CRE的篩選試驗，而Carba NP試驗、聚合酶鏈反應 (Polymerase chain reaction，PCR) 及測序為CRE的確認試驗。每種方法各有其優(yōu)缺點，可根據(jù)當?shù)氐闹饕餍蠧RE型別和實驗條件選擇應用。

2.1 K-B初篩試驗

K-B初篩試驗是最簡便易操作的常規(guī)項目，不需特殊設(shè)備，適合于開展微生物檢驗的任何實驗室。不同的碳青霉烯類抗生素、不同的細菌、不同的耐藥機制，K-B法的選擇用藥不同，如法羅培南目前被認為是檢測產(chǎn)KPC酶菌株最好的指示藥物，如果細菌產(chǎn)KPC酶，法羅培南的抑菌圈直徑往往是6 mm；厄他培南是檢測產(chǎn)碳青霉烯酶菌株最敏感的藥物選擇，產(chǎn)碳青霉烯酶菌通常耐三代頭孢菌素，但SME或者IMI基因型對三代頭孢菌素敏感；對亞胺培南天然非敏感的細菌 (包括摩根摩根菌、變形桿菌屬、普羅威登菌屬) 的CRE篩選則需要參考亞胺培南以外的其他碳青霉烯類抗菌藥物。FDA推薦厄他培南、亞胺培南、美羅培南均可用于腸桿菌科的碳青霉烯類耐藥的篩選，而亞胺培南擴展到對碳青霉烯類耐藥的不動桿菌屬和銅綠假單胞菌的篩選，美羅培南再擴展到對碳青霉烯類耐藥的嗜水氣單胞菌、蜂房哈弗尼亞菌、多殺巴斯德菌、沙門菌屬和志賀菌屬的篩選。

2.2 紙片篩選及協(xié)同試驗

美國臨床與實驗室標準化協(xié)會 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI) 2017年推薦的改良碳青霉烯類滅活試驗 (Carbapenem inactivation method，CIM) 簡便易行，方法是取1 μL接種環(huán)的過夜培養(yǎng)純菌落于2 mL TSB肉湯中，振蕩混勻后放入含10 μg美羅培南的無菌紙片，35 ℃孵育4 h，將美羅培南紙片取出，貼于已涂布有大腸埃希菌ATCC25922的MHA平板上，35 ℃孵育18–24 h，美羅培南抑菌圈直徑為6–15 mm或直徑為16–18 mm但抑菌圈內(nèi)有散在菌落，判斷碳青霉烯酶陽性[12]。CIM 可以檢測出腸桿菌科的多種耐藥基因包括KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48和OXA-23，根據(jù)基因的不同，與PCR方法檢測的結(jié)果符合率達83%–100%[13-14]。美國CDC建議的另一種紙片篩選CRE的方法是將待測細菌接種于2 mL的胰蛋白胨大豆肉湯 (TSB) 中，混勻后加入10 μg的厄他培南或5 μg美羅培南紙片，再轉(zhuǎn)種到麥康凱瓊脂平皿，生長的乳糖發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌即為CRE，但此方法存在假陰性。如果在此基礎(chǔ)上加入3種抗生素 (厄他培南、氟康唑、利奈唑胺) 篩選可降低假陰性6倍，且節(jié)省時間和費用[15]。相比較，紙片協(xié)同試驗也不失為一種簡單、價廉且可靠的檢測和鑒別CRE表型的檢測方法，可在7 h內(nèi)快速鑒定KPC、金屬酶和OXA-48型碳青霉烯酶，對指導臨床救治和感染控制及流行病學監(jiān)測意義重大。方法是以美羅培南紙片 (10 μg) 與美羅培南加EDTA (750 μg) 紙片抑菌圈直徑大于5 mm為金屬酶陽性；美羅培南紙片與苯硼酸 (400 μg) 加美羅培南紙片的抑菌圈直徑大于5 mm為KPC酶陽性；替莫西林紙片 (30 μg) 抑菌圈直徑大于10 mm為OXA-48型碳青霉烯酶，特異性及敏感性均達100%，并證明不同的碳青霉烯類藥物篩選的敏感性無差異[16-17]。不同的酶抑制劑可以檢測某些類別的耐藥機制，如有研究用硼酸、克拉維酸、EDTA協(xié)同抑制試驗篩選178株CRE，56.7%被硼酸抑制，判斷為KPC，7.3%同時被硼酸和克拉維酸抑制，為質(zhì)粒介導的AmpC酶，3.4%被EDTA抑制，為可能金屬酶陽性。另有32.6%硼酸、克拉維酸和 EDTA 抑制試驗均陰性，分析可能產(chǎn)生另一類的β-內(nèi)酰胺酶和/或其他耐藥機制[18]。進一步，Pournaras等應用苯硼酸和EDTA與美羅培南的協(xié)同試驗可直接檢測標本中的CRE (KPC和VIM)，顯示了很好的敏感性 (94.8%) 和特異性 (100%)，進一步加快了報告速度[19]。

2.3 Hodge試驗

CLSI于2015年推薦改良Hodge試驗 (Modified Hodge test，MHT) 篩查CRE，優(yōu)點是操作簡便、價廉，無需特殊的試劑或培養(yǎng)基，僅適用于腸桿菌科細菌產(chǎn)碳青霉烯酶的篩查。應用厄他培南(10 μg)或美羅培南(10 μg)紙片，放在涂有0.5麥氏濁度稀釋10倍的ATCC 25922的大腸埃希菌的平皿上，經(jīng)孵育16–20 h，標準菌株大腸埃希菌ATCC 25922與待檢菌株抑菌環(huán)的交匯處大腸埃希菌生長增強，并呈矢狀，為該待檢菌碳青霉烯酶陽性[20]。MHT檢測CRE的敏感性和特異性分別為89.65%和96.77%[21]。但對金屬酶的檢測敏感性較差，假陽性和假陰性的存在是此方法的弊端。假陽性出現(xiàn)在質(zhì)粒和染色體酶過度表達的產(chǎn)ESBL (Extended-spectrum β-lactamase) 或AmpC酶合并空蛋白缺失的細菌，假陰性出現(xiàn)在某些產(chǎn)NDM (New delhi metallo-lactamase)、OXA和SME的菌株[22-23]，通過加入表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚可以提高金屬酶等的檢測敏感性[24]。

2.4 顯色培養(yǎng)基

近年來，顯色培養(yǎng)基在臨床微生物診斷方面得到廣泛應用，美國CDC推薦其為CRE的快速初篩方法。顯色培養(yǎng)基檢測原理是應用合成顯色酶底物來特異性地鑒定病原體，使目標致病體生長成有色菌落，而使非目標生物體受抑制 (如使用抗生素或其他抑制劑)。顯色培養(yǎng)基具有節(jié)約成本、縮短檢測時間及減少生化與血清學試驗的繁瑣與花費，使病原體確診，并提高了檢出率。自2008年Samra等首次應用并評價科瑪嘉顯色培養(yǎng)基篩選KPC，內(nèi)含有抑制革蘭氏陽性菌和CSE的成分，作者比較科瑪嘉KPC篩選用麥康凱瓊脂培養(yǎng) (貼碳青霉烯類紙片) 和PCR方法檢測KPC基因，敏感性和特異性分別達到92.7%和95.9%，而PCR方法為100%和98.4%[25]。此后，很多商用顯色培養(yǎng)基的試劑不斷開發(fā)，并通過選擇革蘭氏陽性菌和酵母菌的抑制劑、抗生素的濃度、碳青霉烯類敏感腸桿菌科的抑制劑等來增強敏感性和特異性。不同的品牌顯色培養(yǎng)基敏感性和特異性不同，如Brilliance CRE為78%–82%和60%–66%；chromID Carba為91%–96%和76%–89%；Colorex KPC為56%–88%和70%–76%；TSB加厄他培南為78%–99%和10%–69%[26]。Simner進一步評價以上3種顯色培養(yǎng)基的敏感性、特異性和費用，Brilliance CRE、chromID Carba和Colorex KPC的檢測敏感性分別為77.6%、89.8%和83.7%，特異性分別為87.1%、95%和92.1%，費用分別為7.56美元、3.25美元和2.79美元，檢測時間均為18–24 h[27]。而標本拭子直接篩選的敏感性和特異性通常低于純培養(yǎng)菌落的檢測，腸拭子標本的預富集可以提高敏感性，但增加培養(yǎng)時間無意義[28]。敏感性和特異性較低與產(chǎn)AmpC酶或者ESBL酶影響有關(guān)，如果NDM-1對美羅培南的MIC≤2 μg/mL，則顯色培養(yǎng)基篩選效果不佳。提示應根據(jù)不同的地域不同的碳青霉烯酶主導基因型來選擇顯色培養(yǎng)基。

2.5 Carba NP試驗

CLSI 2015年(M100-S25) 抗微生物藥物敏感性試驗的執(zhí)行標準推薦Carba NP (CNP) 試驗，為檢測產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌的表型確證方法。該方法是通過細菌提取物對亞胺培南的水解而改變pH值，導致指示劑的顏色變化而判斷，特點是快速、簡便、低耗，不需要特殊設(shè)備，大部分微生物實驗室可以開展，并可檢測多種碳青霉烯酶。在一項對比研究中，CNP試驗陽性檢測66株CRE的敏感性和特異性分別為89%和100%，檢測的基因包括KPC、NDM、IMP、VIM和SME，只有OXA-48-like 7株均陰性，被推薦為常規(guī)的篩選試驗[29]。另有研究體現(xiàn)CNP診斷CRE快速、低耗。CNP試驗檢測106株CRE的敏感性和特異性分別為66.04%和90.48%，MHT的敏感性和特異性分別為54.72%和93.88%，且有48株CRE用MHT檢測陰性而CNP檢測陽性，甚至厄他培南紙片敏感的菌株CNP檢測陽性18例，每個檢測僅花費0.08歐元，提示CNP診斷對指導臨床早期用藥治療有重要意義[30]。在另一方法的比較研究中，CNP試驗鑒定正確率93.9%，而MHT鑒定正確率90.8%，其中OXA-48、IMP、NDM-1各1株MHT檢測陰性，而OXA-48、IMP和VIM各1株CNP試驗檢測陰性。MHT假陽性31株，CNP試驗無假陽性。兩種方法比較其敏感性無差異，而特異性CNP高于MHT (分別為100%和60.3%，<0.000 1)，且CNP試驗26%在15 min內(nèi)陽性，85%在1 h內(nèi)陽性；建議MHT不宜單獨用于確證CRE的存在[23]。目前CLSI推薦Carba NP試驗主要用于流行病學研究或感染控制，對某些分離株如OXA型及染色體編碼型菌株的篩選效果不好，但在臨床實驗室開展對臨床選擇治療有重要參考意義。基于同樣的原理，類似的試驗方法不斷被改良和優(yōu)化，包括Blue Carba試驗、Rosco Rapid Carb篩查和Rapidec Carba NP試驗，可在臨床實驗診斷過程中借鑒和評價[31-33]。

2.6 PCR及測序

PCR除檢測是否產(chǎn)生碳青霉烯酶外，亦可檢測碳青霉烯酶基因類型，具有準確、靈敏、特異的優(yōu)越性；但其缺點為：需要特殊的實驗室條件及儀器設(shè)備、只對靶基因特異、對未檢測的特異性碳青霉烯酶基因可出現(xiàn)假陰性。在方法學觀察研究中，PCR的敏感性為97%，明顯高于科瑪嘉顯色培養(yǎng)或者選擇性培養(yǎng)，檢測時間僅為24 h，較培養(yǎng)法(64–72 h) 明顯縮短 (<0.000 1)，PCR是最好的篩選CRE的方法[34]。同時PCR的優(yōu)勢是可以精確鑒別一類耐藥基因的每個基因型，單鏈DNA非標記探針法雙聯(lián)溶解高分辨溶解擴增blaOXA-48-like基因，可以清晰區(qū)分OXA162、OXA244、OXA181、OXA232等多種基因[35]。多重PCR的精確設(shè)計進一步克服單純PCR方法的某些不足。如有作者設(shè)計引物包括4種基因，驗證100株產(chǎn)碳青霉烯酶的革蘭氏陰性菌，PCR檢測有一種或多種耐藥基因陽性65株，包括KPC15株、NDM-1 59株、VIM 6株，35株陰性。而MHT檢測僅70%陽性，雙紙片協(xié)同法檢測65%陽性，所有的紙片協(xié)同試驗的菌株，均為金屬酶及KPC，體現(xiàn)了分子檢測的高敏感性及特異性[36]。

2.7 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù) (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization- Time-of-Flight，MALDI-TOF)

MALDI-TOF是近年來快速發(fā)展的微生物鑒定技術(shù)，其工作原理是利用激光作為能量來源輻射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶體，基質(zhì)分子吸收能量與樣品解吸附并使樣品電離，經(jīng)過飛行時間檢測器，將不同質(zhì)荷比(/) 的離子分開，形成細菌特異性的質(zhì)譜圖。用于細菌鑒定在于不同微生物的指紋圖譜各異，指紋圖譜中的某些峰 (分子質(zhì)量) 具有屬、種甚至亞種特異性。MALDI-TOF用于檢測多重CRE耐藥基因包括VIM、IMP、KPC和NDM，源于碳青霉烯類藥物的特征峰的改變，如將試驗菌與美羅培南緩沖液混合，經(jīng)3 h孵育后，將混合液離心取上清檢測，代表美羅培南的特征峰消失，判斷碳青霉烯酶活性，靈敏性和特異性分別為96.67%和97.87%，除去孵育時間的周轉(zhuǎn)時間為4 h[37]，不同的前處理會影響質(zhì)譜鑒定CRE的速度和效果。不同的碳青霉烯類藥物研究的效果不同，MALDI-TOF MS檢測以厄他培南水解的陽性率為100%，亞胺培南水解的陽性率為96.6%[38]。多研究顯示質(zhì)譜儀檢測碳青霉烯酶與常規(guī)方法100%的一致率，包括KPC、VIM和OXA-48基因型，厄他培南孵育3 h，30 min報告結(jié)果，是快速又經(jīng)濟的檢測方法[39]。也有作者用改良的美羅培南水解試驗(MHA) 后進行MALDI-TOF檢測，5% CO2、37 ℃血瓊脂培養(yǎng)過夜的菌株，配置成4.0麥氏單位美羅培南水化物，分為6份 (5個低溫1個常溫)。美羅培南溶解在20 mmol/L Tris-HCl緩沖懸浮液 (pH 6.8)，終濃度為10 mmol/L，立即試驗或在–20 ℃存儲2–3 d。2,5二羥基苯甲酸酸 (DHB) 前處理，再加基質(zhì)上樣。結(jié)果在2 h內(nèi)完成KPC或VIM碳青霉烯酶，包括NDM、OXA-48和CRE，可以很好地區(qū)分產(chǎn)酶與非產(chǎn)酶株，快速且易操作，但不能檢測孔蛋白改變和泵出機制[40]。當然，不同碳青霉烯類藥物的穩(wěn)定性、影響因素的多樣性、耐藥機制的復雜性等均可能影響MALDI-TOF鑒定CRE的效果。

2.8 其他診斷方法

VITEK AST-N202 卡檢測CRE的敏感性達93%–100%，特異性為89.9%。不足之處在于需要特異性試劑及引物，只對靶基因特異，對未檢測的特異酶可能出現(xiàn)假陰性[41]。環(huán)介導等溫擴增法 (LAMP) 檢測KPC，在68 ℃條件下能特異性地檢測KPC，與其他β內(nèi)酰胺酶無交叉反應，靈敏度達100 CFU，比常規(guī)PCR的靈敏度高10倍，檢測時間25 min。LAMP還可以直接檢測痰液、尿液、糞便和血液標本[42]。Xpert Carba-R檢測的耐藥基因包括KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48，檢測正確率97.6%，但耗材高并需要特殊設(shè)備[43]。

3 結(jié)語

不同的檢測方法對不同的耐藥基因的檢測敏感性不同，沒有一個單一理想的方法可以覆蓋所有的耐藥基因和解決所有問題，大數(shù)據(jù)的檢測方法評估需要不斷豐富，實際工作中可根據(jù)腸桿菌科的菌種類型、經(jīng)濟條件、實驗設(shè)備、速度及準確性、當?shù)亓餍械闹饕退幓虻龋C合分析選擇檢測方法，為臨床患者的及時診治及感染控制提供重要保障。

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(本文責編 郝麗芳)

Progress in the diagnosis of carbapenem-resistant

Xuan Xu1,2, and Fen Qu2

1 Peking University Health Science Center, Beijing 100083, China 2 The Medical Center of Clinical Laboratory of 302th Hospital of PLA, Beijing 100039, China

Carbapenem-resistant(CRE) is rising rapidly all over the world, and challenges clinical diagnosis and treatment by various genotypes. This paper summarizes the characteristics and diagnostic methods of CRE. CRE can be divided into three categories and five families with various characteristics and resistant genes. The diagnosis method include the Kirby-Bauer screening test, double disc synergetic inhibition test with carbapenems collaboration (double disc EDTA and meropenem, phenylboronic acid and meropenem), modified Hodge test, chromogenic medium detection for selected test of CRE, and Carba NP colorimetric test, PCR and sequencing for CRE confirmation test. Each method has its own advantages and disadvantages, and can be applied according to the local main popular CRE genetypes and experimental conditions.

carbapenem-resistant(CRE), diagnosis, resistance

December 27, 2017;

May 23, 2018

the Science and Technology Plan Program of Beijing, China (No. 2151100003915151).

Fen Qu. Tel: +86-10-66949691; E-mail: QF302@163.com

北京市科技計劃課題 (No. 2151100003915151) 資助。

10.13345/j.cjb.170522