韓銘鑫，張 琰，喬夢丹，戴雨霖，越 皓，鄭 飛

(長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春130117)

疲勞或亞健康的高發(fā)對人們生活、工作的影響日益顯著，人們對其有效干預(yù)措施的需求更為急切[1-3]。目前，一般通過服用中草藥來延緩或阻止疲勞的發(fā)生或加快疲勞的恢復(fù)[4]。參景五味顆粒為臨床驗方，由人參、五味子、西洋參及紅景天等中藥材組成，具有補腎填精、益氣補血、滋陰清熱及寧心安神等功效，服用后人體陰平陽秘，精神乃治，陰陽平衡，自能緩解疲勞，正氣充足，祛病而延年，長生而久視[5-9]。本研究采用超高壓技術(shù)進行提取，將其開發(fā)為顆粒制劑(批準(zhǔn)文號目前正處于申請階段)。近年來，超高壓技術(shù)在食品殺菌、增加食品安全性及延長冷藏食品貨架期等方面的應(yīng)用較多，此外，其在提取植物天然活性成分方面的應(yīng)用也日趨廣泛[10]。葉陳麗等[11]在超高壓提取與回流提取、超聲提取和水煎煮法分別提取連翹中連翹酯苷A的研究中發(fā)現(xiàn)，超高壓方法的連翹酯苷A提取率最高。超高壓提取法具有操作常溫、有效成分提取率高、提取時間短及能耗低等優(yōu)點。本研究采用單因素及正交試驗法，以人參總皂苷及五味子醇甲為考核指標(biāo)，優(yōu)選參景五味顆粒的最佳提取工藝參數(shù)，并通過小鼠負重游泳實驗及對小鼠血清、肝臟生化指標(biāo)進行測定，考察其抗疲勞功能，為今后該產(chǎn)品顆粒制劑的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200 Series型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；DZTW型電子恒溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；M200 PRO型多功能酶標(biāo)儀(北京世貿(mào)遠東科學(xué)儀器有限公司，TECAN公司)；HPP600 MPa/30 L型超高壓食品處理裝置(包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司)；Centrifuge 5804R型離心機(Eppendonf公司)；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州智博瑞儀器責(zé)任有限公司)；JA5 301 N型電子精密天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ2200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

人參、五味子、西洋參和紅景天購自吉林省仙草醫(yī)藥藥材有限公司；人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品(批號：110754-201626，純度為92.3%)購自中國食品藥品檢定研究院；五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)品(批號：110857-201513，純度≥99%)購自中國食品藥品檢定所；Amberlite XAD-2型大孔吸附樹脂(Sigma公司)；乙醇、甲醇、硫酸、冰醋酸和香草醛均為分析純，購自北京化工廠；肝糖原試劑盒、血尿素氮試劑盒和血乳酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗動物

ICR小鼠[許可證書編號：SCXK(吉)-2011-0004]，來自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 超高壓提取

按處方量稱取藥材，按比例加入一定濃度的乙醇溶劑，混勻，裝入真空包裝袋，排盡氣泡，封口，放入超高壓設(shè)備中進行提取，將壓力升高至所需壓力，保壓一定時間后，快速卸壓，得提取液，濾過，濃縮至一定體積，濾過，備用，待測。

2.2 人參總皂苷含量的測定

2.2.1 對照品溶液的制備：取人參皂苷Re對照品約20 mg，精密稱定，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml含1.846 mg的溶液，即得。

2.2.2 樣品處理：取濃縮至100 ml的提取液10 ml，加水定容至100 ml，吸取1.0 ml試樣進行柱層析。

2.2.3 柱層析：在2 cm直徑層析柱內(nèi)裝入3 cm高的Amberlite XAD-2大孔樹脂，上加1 cm中性氧化鋁。先用70%乙醇25 ml洗柱，棄去洗脫液，再用水25 ml洗柱，棄去洗脫液，精確加入已處理好的試樣溶液1.0 ml，用水25 ml洗柱，以洗去糖分等水溶性雜質(zhì)，棄去洗脫液，用70%乙醇25 ml洗脫人參皂苷，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，水浴揮干，以此做顯色用。

2.2.4 顯色：在上述已揮干的蒸發(fā)皿中準(zhǔn)確加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2 ml，轉(zhuǎn)動蒸發(fā)皿，使殘渣溶解，再加高氯酸0.8 ml，混勻后移入5 ml具塞試管中，于60 ℃以下水浴加熱10 min，取出，冷水冷卻后，準(zhǔn)確加入冰醋酸5.0 ml，搖勻后，以1 cm比色皿于560 nm波長處與標(biāo)準(zhǔn)管一起進行比色測定。

2.2.5 線性關(guān)系考察：吸取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品溶液20、40、60、80及100 μl置于蒸發(fā)皿中，水浴揮干(<60 ℃)，再按“2.2.4”項下方法，與試樣相同，測定吸光度。以吸光度(Y)對總皂苷含量(X)作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=3.819 1X+0.105 2(r2=0.999 6)，總皂苷含量在0.036 9～0.184 6 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 五味子醇甲含量的測定

2.3.1 對照品溶液的制備：精密稱取五味子醇甲對照品5.6 mg，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲(功率：100 W，頻率：30 kHz)10 min后搖勻，即得[12]。

2.3.2 供試品溶液的制備：精密量取濃縮至100 ml的提取液10 ml，蒸干，加適量甲醇溶解殘渣，超聲處理30 min(功率、頻率同上)，并轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3.3 色譜條件：Agilent Eclipse Plus-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，檢測波長254 nm；柱溫35 ℃；進樣量10 μl；流速0.4 ml/min；流動相為水(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～7 min，70%～75%B；7～20 min，75%B)。

2.3.4 線性關(guān)系考察：精密吸取對照品溶液20、40、60、80及100 μl于1 ml容量瓶內(nèi)，加色譜甲醇定容，配制成不同濃度的對照品溶液。按“2.3.3”項下條件進樣測定并記錄五味子醇甲的峰面積。以峰面積(Y)對五味子醇甲濃度(X)作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=4 812.8X-98.886(r2=0.999 7)，五味子醇甲在2.42～11.20 μg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。對照品及供試品溶液的色譜圖見圖1。

A.對照品溶液；B.供試品溶液A. reference solution; B. sample solution圖1 五味子醇甲的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC of schisandrin

2.4 單因素試驗

分別稱取處方量藥材，按超高壓提取方法進行提取，分別考察乙醇濃度、料液比、壓力及保壓時間等因素對活性成分人參皂苷及五味子醇甲提取效果的影響。

2.4.1 乙醇濃度對提取效果的影響：固定料液比1∶6 g/ml，壓力300 MPa，保壓時間5 min，考察乙醇濃度(40%、50%、60%、70%及80%)對提取有效成分的影響[13]。結(jié)果表明，測得總皂苷的含量依次為68.40、78.06、90.46、98.00及100.72 mg/g，五味子醇甲的含量依次為1.77、2.90、3.90、3.91及3.91 mg/g；總皂苷及五味子醇甲的含量隨著乙醇濃度的升高而增加，當(dāng)乙醇濃度>60%時，總皂苷及五味子醇甲的含量趨于平穩(wěn)。因此，選擇乙醇濃度為60%～80%進行正交試驗。

2.4.2 料液比對提取效果的影響：固定乙醇濃度70%，壓力300 MPa，保壓時間5 min，考察料液比(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10及1∶12 g/ml)對提取有效成分的影響。結(jié)果表明，測得總皂苷的含量依次為83.65、91.31、92.48、99.00及105.17 mg/g，五味子醇甲的含量依次為2.62、3.53、3.60、3.67及3.52 mg/g；料液比在1∶6～1∶12 g/ml范圍內(nèi)，總皂苷及五味子醇甲的含量維持穩(wěn)定?？紤]到溶劑成本及后續(xù)回收濃縮時能源的消耗，綜合考慮選擇料液比為1∶6～1∶10 g/ml進行正交試驗。

2.4.3 壓力對提取效果的影響：固定乙醇濃度70%，料液比1∶6 g/ml，保壓時間5 min，考察壓力(200、250、300、350及400 MPa)對提取有效成分的影響。結(jié)果表明，測得總皂苷的含量依次為75.32、88.64、98.51、99.36及102.13 mg/g，五味子醇甲的含量依次為2.39、3.06、3.48、3.51及3.58 mg/g；壓力在200～300 MPa范圍內(nèi)，總皂苷及五味子醇甲的含量隨壓力的增加而增加；當(dāng)壓力升至300 MPa時，有效成分含量變化不顯著，原因可能是隨著壓力的增加，促進有效成分的溶出，當(dāng)壓力達到一定值時，有效成分已充分溶出或達到飽和狀態(tài)。因此，選擇壓力為250～350 MPa進行正交試驗。

2.4.4 保壓時間對提取效果的影響：固定乙醇濃度70%，料液比1∶6 g/ml，壓力300 MPa，考察保壓時間(1、3、5、7及9 min)對提取有效成分的影響。結(jié)果表明，測得總皂苷的含量依次為72.35、90.64、98.52、100.12及101.54 mg/g，五味子醇甲的含量依次為2.47、3.20、3.38、3.41及3.46 mg/g;保壓時間在1～5 min范圍內(nèi)，總皂苷及五味子醇甲的含量隨時間延長而增加，之后隨著時間的增加，有效成分含量基本不變，體系基本達到平衡狀態(tài)。因此，選擇保壓時間為3～5 min進行正交試驗。

2.5 正交試驗設(shè)計

以單因素試驗為基礎(chǔ)，采用超高壓提取法，選擇乙醇濃度(A)、料液比(B)、壓力(C)及保壓時間(D)為考察因素，采用L9(34)進行正交設(shè)計，以提取物中總皂苷和五味子醇甲的含量為考察指標(biāo)。綜合考慮2種成分對緩解疲勞的作用，確定五味子醇甲含量的權(quán)重系數(shù)為0.5，總皂苷含量的權(quán)重系數(shù)為0.5，以確定最佳提取工藝。因素與水平見表1，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels of orthogonal experiment

注：總皂苷含量評分=(50/總皂苷最大含量) ×含量；五味子醇甲含量評分=(50/五味子醇甲最大含量) ×含量；綜合評分=總皂苷含量評分+五味子醇甲評分

Note： score of total saponin content=(50/maximum content of total saponin) × content; score of schisandrin content=(50/maximum content of schisandrin) × content; comprehensive score=score of total saponin content + score of schisandrin score

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

注：F0.05(2,2)=19，F(xiàn)0.01(2,2)=99

方差分析結(jié)果表明，以總皂苷含量及五味子醇甲含量為考察指標(biāo)，影響有效成分提取工藝因素的作用順序為：乙醇濃度>保壓時間>提取壓力>料液比，乙醇濃度、保壓時間及提取壓力的影響有顯著性差異，結(jié)合實際生產(chǎn)的成本和周期，最佳工藝為A2B1C2D2，即6倍量的70%乙醇，提取壓力300 MPa，保壓時間5 min。

2.6 驗證試驗

分別取3份處方量藥材，加入6倍量70%乙醇溶液，排氣密封后加壓至300 MPa，保壓5 min，提取1次，提取液濾過，濃縮，過膜，測得人參總皂苷含量分別為124.55、126.39及127.95 mg/g，RSD為1.34%，五味子醇甲含量分別為3.68、3.65及3.55 mg/g，RSD為1.87%，與預(yù)測值較接近，提取工藝穩(wěn)定可行。

2.7 參景五味提取物的抗疲勞作用研究

2.7.1 動物分組及給藥：選取40只健康的雄性ICR小鼠，體質(zhì)量均為(20±2) g，隨機分為4組，分別為空白對照組和給藥組(低劑量組、中劑量組和高劑量組)。給藥組每日分別灌胃給予參景五味提取液2.70、5.40和10.80 g/kg，空白對照組每日灌胃給予等體積蒸餾水，受試樣品給予小鼠時間為30 d。

2.7.2 小鼠負重游泳實驗：采用約50 cm×50 cm×40 cm的游泳箱，水深30 cm，水溫(25±1.0)℃，末次給予受試樣品30 min后，將尾根部負荷5%體質(zhì)量鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳，記錄小鼠負重游泳力竭時間[3]。結(jié)果如圖2所示，與空白對照組比較，灌胃給予高、中和低劑量的參景五味提取物，均能夠顯著延長小鼠負重游泳的時間(P<0.05)；且隨著給藥劑量的增加，小鼠負重游泳的時間有所延長，表明參景五味提取物具有緩解小鼠運動性疲勞的作用。

圖2 小鼠負重游泳時間Fig 2 Weight-bearing swimming time of mice

表4 參景五味提取物對小鼠生化指標(biāo)的影響Tab 4 Effects of extracts of Shengjingwuwei on biochemical

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

Note： vs. blank group,*P<0.05，**P<0.01

3 討論

研究結(jié)果表明，人參和西洋參的抗疲勞活性成分主要為人參皂苷，紅景天和五味子的抗疲勞活性成分主要為紅景天苷類及木脂素類化合物[15-16]。故本研究在提取工藝中以總皂苷和五味子醇甲作為考察指標(biāo)，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，經(jīng)正交試驗設(shè)計優(yōu)化，確定最佳提取條件為：6倍量的70%乙醇，提取壓力300 MPa，保壓時間5 min。該條件下參景五味顆粒提取物中含有人參總皂苷126.30 mg/g，五味子醇甲3.63 mg/g。

疲勞是一種復(fù)雜的生理心理癥狀，即當(dāng)機體長時間處于過度負重、緊張的環(huán)境狀態(tài)時，引發(fā)的工作效率暫時降低的狀態(tài)。在當(dāng)今社會，因生活壓力的增大而出現(xiàn)疲勞癥狀的人越來越多，年齡分布也較為廣泛。當(dāng)發(fā)生疲勞后，若機體無法得到及時恢復(fù)，疲勞感逐漸積累，會使機體出現(xiàn)內(nèi)分泌紊亂、免疫功能降低等癥狀，嚴(yán)重威脅人們的身體健康[17]。血清BUN、BLA和LG是檢測疲勞的最具代表性、最常用的生化指標(biāo)[17-18]。當(dāng)體內(nèi)LG被大量消耗時，機體的活動能力會隨之降低，從而引發(fā)全身性疲勞。LG貯備的提高有利于機體耐力、速度的提高，并有利于減少蛋白質(zhì)和含氮化合物的分解代謝。本研究結(jié)果表明，參景五味提取物可提高小鼠的運動耐力，減少運動后體內(nèi)的BUN含量和BLA堆積，增加LG的儲備量，為機體提供能量，延緩疲勞產(chǎn)生，但其具體的抗疲勞機制及構(gòu)效關(guān)系還需進一步研究。