方景泉，遲濤，孫廣梅，張釙，徐曉娟，劉芝榮

(1．國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱150028；2．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品學(xué)院，哈爾濱150030)

0 引 言

母乳是人類為哺育后代而分泌的乳汁，是嬰兒階段營養(yǎng)最完備的食物，母乳中的脂肪酸組成和分布對嬰兒后天健康等各個(gè)方面具有重要影響[1]。母乳中的脂肪酸主要由甘油三酯、甘油磷脂和游離脂肪酸組成。測定嬰兒母乳中的脂肪酸具有重要意義，不僅可以指導(dǎo)母乳代用品的研制和開發(fā)(如中國每年約有960萬嬰兒需要補(bǔ)充母乳代用品)，而且，因?yàn)槟溉橹兄舅峤M成與膳食脂肪酸組成相關(guān)[2]，可以通過改善哺乳母親膳食改變母乳脂肪酸的組成，如多不飽和脂肪酸所占比例，滿足嬰兒生長發(fā)育需求。

母乳中的脂肪酸的測定已經(jīng)有很多報(bào)道，常采用有機(jī)溶劑提取、甲酯化后經(jīng)氣相色譜(gas chromatography,GC)分析[3-5]，但這種方法無法獲得脂肪酸在甘油三酯、甘油酯等酯中的分布信息。也有一些文獻(xiàn)采用高效液相色譜質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-mass chromatography,HPLC-MS)分析脂肪酸，可以獲得結(jié)構(gòu)信息，但分析成本過高，不利于大規(guī)模篩查測定。母乳樣品量較少(約為20 m L)還要測定多個(gè)參數(shù)，因此在測定脂肪酸時(shí)在保證檢出度的情況下，盡量選擇較少的樣本量，所以其他柱層析等方法也不適用。

薄層色譜(thin-layer-chromatography,TLC)是上個(gè)世紀(jì)50年代應(yīng)用較多分離極性和非極性成分的技術(shù)[6-8]，近年來，通過改善薄層色譜的制備及操作方法，形成采用高效薄層色譜(high performance thin layer chromatography,HPTLC)和二維薄層色譜(two dimention thin layer chromatography,TDTLC)分離如脂質(zhì)等極性和非極性成分的方法[9]，在樣品的前處理方面顯示出明顯的優(yōu)越性[10]。目前聯(lián)用高效薄層色譜-氣相色譜-四級桿質(zhì)譜檢測人母乳中脂肪酸的研究尚未見報(bào)道。本研究建立了定性定量分析人母乳中脂肪酸初級結(jié)構(gòu)和成分的高效薄層色譜-氣相色譜-四級桿質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，獲得了人母乳脂肪酸成分的分布和結(jié)構(gòu)信息。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器、試劑及耗材

分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；氮吹儀(奧特賽思儀器有限公司)；紫外可見投射反射儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；7890氣相色譜配5975質(zhì)譜(美國安捷倫公司)。

37種混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)；甲醇和正己烷(HPLC級，F(xiàn)isher公司)；顯色劑2,7-二氯熒光素(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；GF254高效薄層色譜板(青島海洋化工廠)；13%～15%三氟化硼甲醇溶液(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；氮?dú)?、氦氣、空氣及氫?哈爾濱黎明氣體有限公司)。所用試劑除特別標(biāo)明外，均為分析純。

樣品：中國東北地區(qū)，1-12周泌乳期母乳。

1.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：SP-2560(100 m×0.25 mm ID 0.20μm)(Sigma公司)。進(jìn)樣口溫度240℃；恒流速模式；進(jìn)樣量1μL；分流比50∶1；程序升溫：140℃(保留5m in)，5℃/m in升至180℃ (保留10 min)，2℃/m in升至210℃(保留15 min)，10℃/m in升至240℃(保留8 min)，共64 min；FID檢測器溫度250℃；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；接口溫度210℃；溶劑延遲：9.5m in。

1.3 甘油酯和甘油磷脂的分離

樣品凍藏：采集的樣品分裝成5 m L離心管內(nèi)，于-80℃冷凍保藏，在保存30 d內(nèi)解凍進(jìn)行脂肪酸分析。

脂肪提取：稱取試樣1.0 g至10 m L試管中，加入0.2 m L氨水，于65℃±1℃水浴鍋中放置15 min，取出輕搖，冷至室溫。在制備好的樣品中加入1 m L乙醇，混勻。加入2.0 m L乙醚，加塞振搖1 min。加入2.0m L石油醚，加塞振搖1 min，靜置、分層，有機(jī)層轉(zhuǎn)入10 m L螺口玻璃管中。再加入2.0 m L乙醚及2.0m L石油醚，加塞振搖1 min，靜置、分層，有機(jī)層轉(zhuǎn)入螺口玻璃管，加1.0m L乙醚及1.0m L石油醚再重復(fù)操作一次。合并抽提液于螺口玻璃管中，氮吹干。得濃縮物。

甘油酯分離：向上述濃縮物中加入100μL三氯甲烷，用1 m L注射器吸取點(diǎn)樣，把點(diǎn)好樣的硅膠板放入層析缸中，緩慢充入氮?dú)?0 min，然后蓋嚴(yán)層析缸。等到層析液沿硅膠板上升到頂部時(shí)，取出硅膠板。氮?dú)獗Ｗo(hù)晾干，在硅膠板上方噴灑顯色劑0.1%2,7-二氯熒光黃顯色，在紫外燈365 nm下照射下觀察。用鉛筆畫出各個(gè)條帶的范圍。上部明亮區(qū)是甘油三酯，下部明亮區(qū)是甘油二酯，中間細(xì)微明亮的地方是游離脂肪酸，最下部分為甘油一酯。

甘油磷脂分離：將上述濃縮物用1 m L三氯甲烷溶解，把溶液注入硅膠柱中，用0.5 m L三氯甲烷清洗2～3次，洗液并入硅膠柱，用10m L三氯甲烷洗脫非甘油磷脂成分，再用12 m L甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，用氮?dú)獯蹈?，得到甘油磷脂?/p>

1.4 脂肪酸甲酯化處理

在提取的母乳脂肪濃縮物中加入0.1m L焦性沒食子酸甲醇溶液。氮吹濃縮干燥，加入1m L氫氧化鉀甲醇溶液置于80℃±1℃水浴上回流5～10 min。再加入0.5 m L三氟化硼甲醇溶液，繼續(xù)回流15 min，冷卻至室溫，將磨口玻璃管中的液體移入10m L離心管中，分別用0.3 m L飽和氯化鈉溶液清洗磨口玻璃管三次，合并飽和氯化鈉溶液于10 m L離心管，加入1 m L正己烷，振搖后，以5 000 r/m in離心5 min，取上清液作為試液，供氣相色譜儀測定。

1.5 樣品儲藏穩(wěn)定性試驗(yàn)

樣品采集后，投入液氮中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，將同一母乳樣品分成30份分別儲藏在-20℃和-80℃冰箱內(nèi)進(jìn)行儲藏時(shí)間試驗(yàn)，每隔6 d取樣一次。外標(biāo)法測定總脂肪中多不飽和脂肪酸DHA(docosahexaenoic acid,DHA)、花生四烯酸(arachidonic acid,ARA)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，直至數(shù)據(jù)具有顯著性差異，為最長保存時(shí)間。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品儲藏及取樣量

母乳樣品的儲藏方式直接決定樣品中脂肪及脂肪酸的穩(wěn)定性，本研究通過比較DHA、ARA脂肪酸在儲存期間質(zhì)量濃度的變化，對質(zhì)量濃度按照時(shí)間順序進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果表明，儲藏在-20℃的樣品，測定到第36 d時(shí)，ARA質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.39%顯著性減少至0.34%；DHA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.37%顯著性減少至0.30%。儲藏在-80℃的樣品，測定到第72 d時(shí)，ARA質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.39%顯著性減少至0.33%；DHA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.37%顯著性減少至0.31%。儲藏溫度對脂肪酸的影響結(jié)果這與Lacom ba等[11]的研究結(jié)果類似，變化范圍與Yuhas等[3]的研究結(jié)果類似。因此，短時(shí)間能夠測定的樣品儲存在-20℃冰箱中，長期保存樣品儲存在-80℃冰箱中。

因母乳樣品有限，測定時(shí)要盡量使用較少的樣品進(jìn)行檢測。每個(gè)地區(qū)隨機(jī)取12個(gè)樣品，一開始稱樣量為5.00 g，隨后不斷減少樣品稱樣質(zhì)量，以脂肪質(zhì)量百分比2.0%和檢出限2倍為最低稱樣量。最終確定最低稱樣質(zhì)量為1.06±0.16 g。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 薄層色譜分離條件優(yōu)化

TLC是將脂類在層析缸內(nèi)用展開劑把各組分在硅膠板上進(jìn)行展開，根據(jù)各組分的極性和硅膠的吸附能力各不相同，將組分在硅膠板上分離開。展開液的極性組成及硅膠板的厚度決定了甘油三酯、甘油二酯、游離脂肪酸、甘油一酯的分離程度。硅膠板選擇0.25 mm及0.35 mm兩種。0.35 mm的薄層板硅膠層太厚，樣品分離時(shí)間長，分離條帶不夠清楚。因此選用0.25 mm厚度的硅膠板作為分離板。在展開液優(yōu)化中，將乙醚的量逐漸加大，直至各條帶明顯分開。圖1顯示了展開液優(yōu)化前后的對比。展開液組成為正己烷、乙醚和冰醋酸(體積代為70∶30∶1)時(shí)，效果較好，甘油三酯、甘油二酯、游離脂肪酸、甘油一酯清晰可見且分布均勻。紫外燈波長選擇365 nm和254 m n同時(shí)照射效果較好，這與Zaim a[12]等采用的雙波長方法一致。

4.執(zhí)法人員的綜合素養(yǎng)有待提高。作為落實(shí)“誰執(zhí)法誰普法”責(zé)任制的直接責(zé)任人，執(zhí)法人員的專業(yè)素質(zhì)和法治素養(yǎng)直接決定了“誰執(zhí)法誰普法”的工作實(shí)效。落實(shí)“誰執(zhí)法誰普法”責(zé)任制，對一線的執(zhí)法人員提出了更高的要求，不僅專業(yè)要過硬，更要有良好的法治素養(yǎng)。調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，部分執(zhí)法人員專業(yè)業(yè)務(wù)過硬，但法治素養(yǎng)較弱，運(yùn)用法治思維與法治方式解決問題的能力還不夠強(qiáng)，在面對群眾釋法說理上存在一定的短板。

本研究為增加脂肪酸的檢出率，并沒有采用通常的點(diǎn)狀點(diǎn)樣法，而是采用條形點(diǎn)樣法。將常用的尖頭點(diǎn)樣針磨平，點(diǎn)上焊錫后磨圓，形成圓形的點(diǎn)樣針頭，防止將硅膠層劃破，導(dǎo)致樣品遷移速度不一致。點(diǎn)樣時(shí)在距離薄層板短邊1.5 cm處均勻加載樣品，邊加載樣品，邊用氮?dú)獯蹈?，可反?fù)多次，直至將100μL全部加載到薄層板上。

圖1 展開液優(yōu)化前1-a和展開液優(yōu)化后1-b對比

在高效薄層色譜展開時(shí)，向展開缸內(nèi)緩緩?fù)ㄈ氲獨(dú)夂笊w嚴(yán)，用于保護(hù)多不飽和脂肪酸，尤其是游離脂肪酸中含有的多不飽和脂肪酸避免氧化，并使測定結(jié)果穩(wěn)定。游離脂肪酸的空間折疊結(jié)構(gòu)使雙鍵暴露在外，如不進(jìn)行氮?dú)獗Ｗo(hù)展開和晾干，很難在游離脂肪酸中測出多不飽和脂肪酸。與甘油結(jié)合的脂肪酸，雖然部分雙鍵暴露在外，但極性較小，容易溶于有機(jī)溶劑而受到保護(hù)。

2.2.2 質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍的確定

為了對人母乳中所有可能存在的脂肪酸進(jìn)行識別和檢測，采用全掃描模式進(jìn)行分析。由于有些色譜峰小且狹窄，我們采用了儀器所能提供的較高的掃描頻率。

母乳中短鏈脂肪酸特征離子從55.1開始，集中在55～150的范圍內(nèi)，中鏈脂肪酸范圍從55～250，長鏈脂肪酸從55～300，最后都有一個(gè)472的特征離子。樣品中出峰的特征離子范圍大多在55～200之間。因此質(zhì)量掃描范圍的起始值定位50。母乳中目前發(fā)現(xiàn)的脂肪酸的最大碳原子數(shù)是24，選擇500為最大質(zhì)荷比。在上述質(zhì)量掃描范圍內(nèi)，掃描速率為20 000 am u/s，掃描頻率約為35 H z。上述質(zhì)譜參數(shù)與其他研究者脂肪酸質(zhì)譜測定參數(shù)類似[13-14]，能夠滿足所有脂肪酸的定性定量分析。圖2是37種脂肪酸的質(zhì)譜圖。37種脂肪酸分離效果良好，只有一種順反異構(gòu)脂肪酸分離度為0.8，其他脂肪酸分離度均大于1。圖3是泌乳期25 d的樣品的譜圖，25 d時(shí)，母乳中脂肪酸的種類最多且達(dá)到平衡。從圖中可以看出，所有峰分離度均大于1。含量較低的月桂酸也得到檢出。

圖2 37種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)譜圖

圖3 泌乳期25天樣品譜圖

37種脂肪酸特征離子見表1。使用了特征離子定性，從圖3可以看出，即使分離度稍差，也能得到很好的定性。定量時(shí)，并沒有使用所有特征離子作為定量離子，部分脂肪酸沒有獲得穩(wěn)定的定量離子，沒有獲得穩(wěn)定定量離子脂肪酸，將采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。但因?yàn)橘|(zhì)譜定量的局限性，對于某些需要確認(rèn)準(zhǔn)確含量的脂肪酸，采用FID檢測器精確定量。

2.3 檢出限與定量下限

分別準(zhǔn)確稱取22.2、26.0、19.0、21.0、16.0、24.0的亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、油酸、肉豆蔻算和硬脂酸，配置標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照濃度由低到高的順序分別對標(biāo)準(zhǔn)混合液進(jìn)行測定，并將測得的ELSD峰面積Y與其標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x，mg/L)進(jìn)行線性回歸分析，得到6種高級脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。選擇合適的最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測定10次，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為測定的檢出限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為測定的定量下限。結(jié)果顯示，該方法具有線性范圍寬、檢出限低的特點(diǎn)。

表1 37種脂肪酸的特征離子

2.4 方法的精密度與回收率

選定母乳樣品，優(yōu)化條件下平行測定7次以下項(xiàng)目，計(jì)算回收率，測試結(jié)果和方法的精密度。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，將DHA、EPA、亞油酸、α-亞麻酸和γ亞麻酸5種脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)工作液加入到母乳樣品中，將加標(biāo)和未加標(biāo)的母乳樣品按照選定的樣品處理方法進(jìn)行處理后，采用優(yōu)化的方法進(jìn)行分析。根據(jù)各種高級脂肪酸在加標(biāo)和未加標(biāo)樣品中的測定量以及加入標(biāo)準(zhǔn)品的含量計(jì)算該方法的回收率，結(jié)果列于表2。從表2可知，各脂肪酸測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.9%～13.5%之間，加標(biāo)回收率在83%～104%之間，表明本方法有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確度，滿足母乳樣品中脂肪酸的定量要求。

表2 方法回收率和精密度(n=5)

2.5 樣品分析

本研究選擇東北地區(qū)36份母乳樣品進(jìn)行定性定量分析，取其中5位母親混合母乳的泌乳期7、12、25、30母乳樣品進(jìn)行總脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、甘油磷脂中的脂肪酸組成及分布的測定。表3是泌乳7天時(shí)脂肪酸的分布圖。從表中可以看出，泌乳初期，無游離脂肪酸，而且初期脂肪酸種類較少。甘油三酯、甘油二酯、甘油磷脂中的脂肪酸與總脂肪酸并非一一對應(yīng)，可能是在總脂肪酸提取的時(shí)候，由于衍生溫度等條件、脂肪酸種類等不同，導(dǎo)致一些脂肪酸未甲酯化或未測出。甘油三酯、甘油二酯、甘油磷脂中的脂肪酸種類大于總脂肪酸，說明本方法相比直接測定總脂肪酸，能夠獲得更為豐富的脂肪酸分布信息。

另外，甘油三酯中脂肪酸分布較廣，與總脂肪酸分布類似，這是因?yàn)槟溉橹兄?5%均為甘油三酯[15]。甘油二酯中的脂肪酸主要是中長鏈脂肪酸。甘油一酯中脂肪酸是長鏈和短鏈脂肪酸，甘油磷脂中主要是中長鏈脂肪酸，其中不飽和脂肪酸所占比例較大。隨著泌乳期的變化，各甘油酯中的脂肪酸組成也不斷變化，這泌乳期內(nèi)飲食的變化直接相關(guān)，但是有一些脂肪酸發(fā)生變化很少。這些很少發(fā)生變化的脂肪酸可能對于嬰兒健康和乳汁組成具有重要作用。需要通過此測定方法進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究建立了人母乳中總脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、甘油磷脂中脂肪酸分布的高效薄層色譜-氣相色譜-質(zhì)譜分析方法。方法的主要脂肪酸的檢出限范圍為2.1～2.4 m g/L，回收率在83%～104%之間，滿足測定要求。通過該方法測定了人母乳樣品的脂肪酸相比直接測定總脂肪酸，能夠獲得更為豐富的脂肪酸分布信息。

表3 泌乳7d時(shí)脂肪酸的含量