趙玉娟，段翠翠，高磊，牛春華，于雪，李盛鈺

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，長春 130033）

0 引 言

粘附是乳桿菌細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)與宿主腸上皮細(xì)胞和黏膜表面受體的相互作用，是乳桿菌定植的第一步，是乳桿菌得以在宿主體內(nèi)生長繁殖并發(fā)揮其益生作用的前提。本課題組自內(nèi)蒙古奶豆腐中分離、鑒定得到植物乳桿菌C 88，大量的研究結(jié)果表明，該菌株具有良好的益生特性（耐酸、耐膽鹽等）、功能特性（抗氧化[1]、降膽固醇[2]等）和發(fā)酵特性[3]，具有作為益生菌開發(fā)的潛力。為了進一步提高該菌株的粘附能力，本課題利用基因組選育技術(shù)獲得四株粘附能力增強的重組菌株[4]。為了驗證重組菌株在宿主腸道的粘附情況和對腸道菌群的影響，本研究以昆明小鼠構(gòu)建動物模型，通過觀察野生菌株和重組菌株在小鼠腸道內(nèi)的定植能力、粘附能力和對腸道內(nèi)微生物菌群的調(diào)節(jié)能力，來評價重組菌株的益生功效，為重組菌株后續(xù)的應(yīng)用和產(chǎn)品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生菌株（植物乳桿菌C 88）和基因重組菌株（植物乳桿菌F3-1、F3-2、F3-3和 F3-4）為本試驗室保藏，菌株在含體積分?jǐn)?shù)為30%甘油的M RS培養(yǎng)基中，-80℃凍存。使用前接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃活化2次。將活化好的植物乳桿菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期，6000×g，4℃，離心10 min，收集菌泥，用無菌PBS溶液重懸，平板計數(shù)測定菌數(shù)，將菌懸液濃度調(diào)整至1×109cfu/m L備用。

昆明小鼠（4周齡，雄性，18～22 g），小鼠常規(guī)飼料，購自長春市高新醫(yī)學(xué)動物中心。

異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC），Biotium Inc.公司，購自上海開放生物有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

乳桿菌培養(yǎng)基（LBS）、雙歧桿菌培養(yǎng)基（MRS+NNLP）、腸道菌培養(yǎng)基（VRBDA）、腸球菌培養(yǎng)基（BEA）、產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基（TSC），參照文獻(xiàn)方法[5]配制.

1.3 實驗動物飼養(yǎng)

動物室溫度22℃，相對濕度55%，每天更換墊料，控制每日日光12 h，黑暗12 h。喂普通飼料，蒸餾水。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，每天定點灌胃乳桿菌菌液。

1.4 菌株在小鼠腸道內(nèi)的定植研究

將小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為空白對照組、C 88組、F3-1組、F3-2組、F3-3組和F3-4組。空白對照組小鼠每次灌胃0.4 m L無菌PBS，實驗組分別灌胃0.4 m L C 88、F3-1、F3-2、F3-3和F3-4菌液，連續(xù)灌胃7 d。分別于0、7 d和實驗結(jié)束后第7 d，斷頸處死小鼠（每次實驗取2只小鼠），無菌取小鼠空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物進行乳桿菌總數(shù)測定。

1.5 菌株在小鼠腸道內(nèi)的粘附性研究

（1）細(xì)菌熒光標(biāo)記

采用FITC熒光染色方法標(biāo)記細(xì)菌[6]，調(diào)整菌株終濃度為2×109cfu/m L。

（2）冰凍組織切片

實驗小鼠灌胃0.4 m L菌液，連續(xù)灌胃3 d。在處理的前一天，實驗小鼠禁食不禁水，實驗結(jié)束當(dāng)天，斷頸處死小鼠后無菌取出小鼠空腸，將組織平放于無菌錫紙上，加入適量的OTC包埋劑，浸沒組織，緩慢放入盛有液氮的小燒杯中，液氮冷凍成型，-80℃保存[7]。采用Leica冷凍切片機CM 1900制作切片，使用O lympus激光共聚焦顯微鏡進行熒光檢測。

1.6 菌株對小鼠腸道微生物菌群的影響

將小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為空白對照組、C 88組、F3-1組、F3-2組、F3-3組、F3-4組，空白對照組小鼠每次灌胃0.4m L無菌PBS，實驗組分別灌胃0.4m L C 88、F3-1、F3-2、F3-3、F3-4、菌液，連續(xù)灌胃7 d。分別于0、7 d和實驗結(jié)束后第7 d，斷頸處死小鼠（每次實驗取3只小鼠），無菌取小鼠糞便，測定糞便中主要菌群。

宏基因組分析：選擇野生菌株C 88組、粘附性較強的重組菌株F3-3、F3-4進行小鼠腸道菌群宏基因組分析。分別于0、7 d和實驗結(jié)束后第7 d，斷頸處死小鼠，無菌取小鼠糞便，利用試劑盒提取小鼠糞便中的基因組，送至上海派森諾生物科技有限公司利用宏基因組16SV1-V3區(qū)檢測小鼠腸道微生物的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株在小鼠腸道內(nèi)的定植能力分析

乳桿菌在小鼠腸道內(nèi)的定植主要集中在小腸末端和大腸中部，所以本研究選擇小鼠的回腸、盲腸和空腸來研究野生菌株和重組菌株在小鼠腸道的定植情況，結(jié)果見表1。實驗期間，對照組小鼠盲腸、回腸和空腸內(nèi)容物中乳桿菌的數(shù)量沒有明顯區(qū)別，基本保持穩(wěn)定。實驗組小鼠灌胃野生菌株C 88、重組菌株F3-1、F3-2、F3-3、F3-4后，小鼠腸道不同部位內(nèi)容物的乳桿菌數(shù)量明顯上升，其中盲腸定植的數(shù)量最高，其次是結(jié)腸，回腸中最少，在灌胃第7 d數(shù)量達(dá)到最高，灌胃C 88組盲腸中乳桿菌的活菌數(shù)達(dá)到8.15 log CFU/g，灌胃重組菌株實驗組活菌數(shù)達(dá)到8.23～8.52 log CFU/g，結(jié)果表明重組菌株的定植能力高于野生菌株。停止灌胃7天后，各腸道內(nèi)容物的乳桿菌數(shù)量與灌胃期間相比有所下降。實驗結(jié)果表明，菌株在小鼠腸道內(nèi)的定植時間小于7 d。徐致遠(yuǎn)[8]對植物乳桿菌ST-III在小鼠腸道內(nèi)定植情況進行研究，結(jié)果表明定植主要集中在小腸末端和大腸中部，各部位腸道定植的數(shù)量也不同，結(jié)腸內(nèi)定植最多，回腸內(nèi)其次，在各部位定植的時間也不同，在結(jié)腸內(nèi)定植時間最長。

2.2 乳桿菌在小鼠腸道內(nèi)的粘附

免疫組化激光共聚焦成像方法觀察野生菌株和重組菌株在小鼠腸道內(nèi)黏附的情況，具體結(jié)果如圖1所示。與植物乳桿菌C 88相比，重組菌株的粘附增強不同，重組菌株F3-3和F3-4表現(xiàn)出比F3-1和F3-2更強的粘附率。此外，重組菌株F3-4的粘附性稍微高于重組菌株F3-3。實驗證明，乳桿菌能夠粘附在小鼠體內(nèi)，且重組菌株的粘附能力較野生菌株明顯提高。

2.3 菌株對小鼠腸道內(nèi)微生物菌群的影響

2.3.1 菌株對小鼠腸道菌群的影響

實驗小鼠灌胃野生菌株和重組菌株后，檢測小鼠腸道內(nèi)的乳桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量，具體結(jié)果見圖2。

表1 小鼠腸道乳桿菌活菌數(shù)量計數(shù)

實驗期間對照組小鼠腸道內(nèi)益生菌和有害微生物的數(shù)量變化不顯著，而灌胃野生菌株C 88和重組菌株F3-1、F3-2、F3-3、F3-4后，小鼠腸道微生物在灌胃7 d后發(fā)生明顯的改變，具體如圖2 A-E所示。小鼠腸道內(nèi)益生菌的數(shù)量明顯增加，與對照組相比差異顯著（P＜0.05），灌胃野生菌株C 88后，腸道內(nèi)乳桿菌（圖2 A）的數(shù)量為3.1×108cfu/g，雙歧桿菌（圖2B）的數(shù)量為2.5×108cfu/g，而灌胃重組菌株后腸道益生菌的數(shù)量更多，其中灌胃重組菌株F3-4后乳桿菌（圖2A）的數(shù)量達(dá)到3.2×109cfu/g，雙歧桿菌（圖2B）達(dá)到8.4×108cfu/g，分別是野生菌株的10倍和3.3倍，因此重組菌株更有利于增加小鼠腸道內(nèi)益生菌的數(shù)量。另外，灌胃野生菌株和重組菌株可以抑制小鼠腸道有害微生物的黏附，如灌胃重組菌株后顯著降低小鼠腸道內(nèi)腸球菌（圖2 D）的數(shù)量（P＜0.05），灌胃野生菌株C 88后，小鼠腸道內(nèi)腸球菌的數(shù)量由2.6×107cfu/g降低至2.05×107cfu/g，而灌胃重組菌株F3-4則由2.1×107cfu/g降低至6.6×106cfu/g，說明重組菌株對有害微生物的競爭性抑制作用更強。石超[9]通過給高脂飼喂模型大鼠灌胃植物乳桿菌Lp3后，大鼠類便中乳桿菌數(shù)略高于對照組，大腸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量和對照組大鼠的基本一致，與本研究結(jié)果相一致。

通過以上實驗可以得出結(jié)論，小鼠喂飼野生菌株和重組菌株一段時間，可以顯著提高小鼠糞便中乳桿菌的數(shù)量，降低腸球菌數(shù)量（P＜0.05），對雙歧桿菌、腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量無顯著影響（P＞0.05），說明植物乳桿菌C 88和重組菌株對小鼠腸道菌群具有明顯的調(diào)節(jié)作用，且重組菌株的調(diào)節(jié)能力高于野生菌株。

2.3.2 宏基因組分析小鼠腸道內(nèi)微生物菌群的情況

2.3.2.1 基于多元統(tǒng)計方法樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比較分析

從圖3可以看出，灌胃重組菌株F3-3、F3-4組與空白對照組相比完全是分離的，不存在交疊現(xiàn)象。而灌胃植物乳桿菌C 88組與灌胃重組菌株F3-3、F3-4組有樣品交疊的趨勢，說明有些分類操作單元在灌胃野生菌株與灌胃重組菌株的樣品中同時存在，只是乳桿菌的數(shù)量存在差異。

圖1 小鼠空腸組織切片觀察乳桿菌的粘附情況

圖2 灌胃菌株對小鼠糞便中微生物菌群數(shù)量的影響

2.3.2.2 基于屬水平不同樣品腸道菌群分析

在屬水平上，我們對各樣品中豐度＞1%的屬進行了統(tǒng)計，所有小鼠糞便樣品中相對豐度較高的屬共檢測到14個。分別為擬桿菌門的擬桿菌綱擬桿菌科（Bacteroidaceae）的Bacteroides，普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）的Prevotella，理研菌科（Rikenellaceae）、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)的Parabacteroides，帕拉普雷沃氏菌科（Paraprevotellaceae）的Prevotella。厚壁菌門的毛羅菌科（Lachnospiraceae），瘤胃菌科（Ruminococcaceae）的Oscillospira及Ruminococcus。變形菌門的立克次氏體目（Rickettsiales），產(chǎn)堿桿菌科（A lcaligenaceae），脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae），螺桿菌科（Helicobacteraceae），腸桿菌科（Enterobacteriaceae）。無壁細(xì)菌類的支原體科（M ycoplasmataceae）。

基于屬水平樣品中細(xì)菌相對含量(序列所占比例)的比較分析發(fā)現(xiàn)，因乳酸菌和雙歧桿菌在糞便中不是優(yōu)勢菌群，所以C88和重組菌株對這些益生菌的調(diào)節(jié)作用結(jié)果不顯著。但是灌胃植物乳桿菌C 88和重組菌株調(diào)節(jié)了小鼠糞便中致病菌及其他細(xì)菌的含量，如普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、帕拉普雷沃氏菌科（Paraprevotellaceae）、立克次氏體目（Rickettsiales）、支原體科（M ycoplasmataceae）在對照組小鼠糞便中的含量為19.4%、10.9%、5.9%、3.9%、18.5%，而灌胃C 88 7 d后降低為6.6%、4.7%、1.2%、0.5%、1.0%，灌胃F3-3降低為6.6%、5.1%、0.2%、0.7%、3.6%，灌胃F3-4降低為5.8%、2.6%、0.0%、0.5%、1.5%，結(jié)果表明植物乳桿菌C 88和重組菌株F3-3、F3-4顯著降低了小鼠糞便中致病菌及其他細(xì)菌的含量，且重組菌株F3-3、F3-4的調(diào)節(jié)能力稍強于野生菌株。

3 討論

乳酸菌作為腸道中生理性細(xì)菌發(fā)揮益生功能的前提是能夠有效定植于腸道上皮細(xì)胞中，而菌株的粘附能力又是定植的保障。本課題組為了提高乳桿菌在體內(nèi)的粘附能力，采用基因組改組的技術(shù)篩選出四株重組菌株，重組菌株各方面性能明顯高于野生菌株，尤其是粘附能力是野生菌株的2倍[4]。近年來科研人員常采用熒光標(biāo)記的方法對乳酸菌在腸道內(nèi)的粘附能力進行驗證，雖然熒光標(biāo)記染料很多，但FITC是用于乳酸菌示蹤較常用的一種。Edelm an等[10]利用FITC標(biāo)記Lactobacillus crispatusSTl表面蛋白，觀察乳酸桿菌粘附植物上皮細(xì)胞和人陰道上皮細(xì)胞。任鵬飛[11]利用FITC標(biāo)記L.rhamnosusCICC 6141，觀察熒光乳酸菌在斑馬魚腸道內(nèi)的粘附情況，結(jié)果表明標(biāo)記的L.rhamnosusC ICC 6141可以在斑馬魚的腸道中觀察到較強的綠色熒光。本研究為了驗證重組菌株與野生菌株在動物體內(nèi)的粘附能力，利用FITC對不同菌株進行熒光標(biāo)記后觀察菌株對小鼠腸道上皮細(xì)胞的粘附能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠的空腸中有大量的綠色熒光，說明菌株已有效的粘附于小鼠腸道內(nèi)，且重組菌株的數(shù)量較野生菌株多。

益生菌粘附于腸道后發(fā)揮的主要作用是維持和調(diào)節(jié)宿主的正常腸道菌群，并以此為基礎(chǔ)發(fā)揮其益生特性。乳桿菌對腸的粘附能力會對宿主自身菌群的組成造成影響，從而影響它們與宿主細(xì)胞和其他菌株之間的相互作用[12-13]，形成并維持腸道的動態(tài)平衡。尚楠等[14]研究結(jié)果顯示雙歧桿菌RH活菌、菌體破碎物及發(fā)酵上清液均可使小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量極顯著增加（P＜0.01），產(chǎn)氣莢膜梭菌和腸球菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05和P＜0.01），并能使腸桿菌和擬桿菌數(shù)量恢復(fù)至正常水平。W ang等[15]結(jié)果證明實驗動物和受試人群糞便中的雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量顯著增加，腸桿菌數(shù)量顯著降低，這種含有益生菌和益生元的發(fā)酵乳制品可以促進腸道健康。M ontesi等[16]利用小鼠模型驗證含有益生元（低聚果糖）或益生菌（乳雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌）的嬰兒奶粉潛在的益生作用，與對照組相比，益生菌組小鼠糞便中梭菌和擬桿菌的數(shù)量顯著下降，總厭氧菌數(shù)量顯著下降。本研究獲得相類似的研究結(jié)果，通過給小鼠灌胃野生菌株和重組菌株，小鼠糞便中乳桿菌的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），而腸球菌的數(shù)量顯著降低（P＜0.05），同時宏基因組測序結(jié)果表明灌胃乳桿菌顯著降低了試驗小鼠糞便中致病菌和其他細(xì)菌的數(shù)量，證明所灌胃的重組菌株和野生菌株均具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，且重組菌株的調(diào)節(jié)能力高于野生菌株C 88。以上結(jié)果說明經(jīng)基因組改組選育的重組菌株F3-3和F3-4由于提高了菌株的粘附能力，可有效的定植在小鼠腸道內(nèi)形成生物占位，抑制了致病菌和其他細(xì)菌的定植，因此減少了致病菌和其他細(xì)菌的數(shù)量。本研究結(jié)果為進一步揭示乳桿菌發(fā)揮益生作用的分子機制提供數(shù)據(jù)支撐。

圖3 灌胃乳桿菌對受試小鼠腸道菌微生物菌群構(gòu)成影響的多樣性分析圖

圖4 灌胃不同乳桿菌糞便腸道微生物中相對含量較多的細(xì)菌屬的熱圖