劉君花，歐陽恩鴻，賀志明，魏海諒，羅湘軍

(1.邵陽學(xué)院 附屬第二醫(yī)院，湖南 邵陽,422000；2.邵陽學(xué)院 藥學(xué)院，湖南 邵陽,422000； 3.邵陽學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖南 邵陽,422000)

虎杖苷又名白藜蘆醇苷，廣泛用于心血管疾病的治療，已有文獻(xiàn)報(bào)道其降血脂作用[1]，但對(duì)其降血脂機(jī)制報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，探討虎杖苷對(duì)其血脂的調(diào)節(jié)作用，與對(duì)CD36、VCAM-1表達(dá)的影響，以期為虎杖苷開發(fā)成為調(diào)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物及試劑

虎杖苷(上海純優(yōu)生物科技有限公司提供，含量>98%)；辛伐他汀(杭州默沙東制藥有限公司)；TC試劑盒，TG試劑盒，HDL-C試劑盒，LDL-C試劑盒，均由sigma公司提供。

1.2 儀器

J-25型高速冷凍離心機(jī)(美國貝克曼公司)，酶標(biāo)儀(Model 680)：BIO-RAD公司。

1.3 動(dòng)物

雄性SD大鼠，體重200～250g，金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司(濟(jì)南)。

1.4 高脂飼料

81.3%基礎(chǔ)飼料，10%豬油，5%白糖，3%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶，以上飼料均購自湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型建立

SD大鼠60只，隨機(jī)分為2大組：普通飼料組(正常對(duì)照組，n=10)和高脂飼料組(n=50)，普通飼料組給予普通飼料，高脂飼料組給予高脂飼料。喂養(yǎng)4周后，眼眶取血，測(cè)定血脂。高脂飼料組按血脂水平隨機(jī)平均分成5組：(1)模型組：蒸餾水，ig 5mg·kg-1·d-1；(2)陽性藥物組：辛伐他汀，ig 5mg·kg-1·d-1；(3)虎杖苷高劑量組：虎杖苷，ig 160mg·kg-1·d-1；(4)虎杖苷中劑量組：虎杖苷，ig 80mg·kg-1·d-1；(5)虎杖苷低劑量組：虎杖苷，ig 40mg·kg-1·d-1。從第5周開始，分組給予以上藥物(或蒸餾水)，正常對(duì)照組以普通飼料喂養(yǎng)，高脂飼料組給予高脂飼養(yǎng)，飼養(yǎng)8周。

2.2 體重測(cè)定

測(cè)定大鼠體重，記錄大鼠體重變化，測(cè)定時(shí)間分別為造模前及造模后第 4周、8周、12周。

2.3 血脂測(cè)定

造模后第12周，眼眶采血，分離血清，依試劑盒說明書操作，檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)濃度。

2.4 組織形態(tài)學(xué)觀察

造模后第12周，處死大鼠。取大鼠肝臟，以4%多聚甲醛液固定、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察。

2.5 CD36與VCAM-1表達(dá)檢測(cè)

末次給藥后，處死實(shí)驗(yàn)大鼠，取主動(dòng)脈3～5cm，以PBS沖洗，再用4%甲醛固定。冰凍切片后，冷丙酮固定10min后晾干。以PBS液沖洗3次，每次2min。加山羊血清封閉，在室溫下孵育10min。倒掉血清后，分別加入VCAM-1和CD36一抗，在37℃條件下孵育1h。PBS沖洗3次，每次2min。加入快速免疫組化Max Vision TM二抗，再在室溫條件下孵育10～15min。以PBS沖洗3次，每次沖洗2min。加入新配顯色劑(DAB)，顯色3～5min后，置顯微鏡下觀察。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，流水沖洗返藍(lán)。梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對(duì)照組中以PBS緩沖液替代一抗。以免疫組織化學(xué)法測(cè)定試樣中VCAM-1和CD36的表達(dá)。利用康克新柏圖文分析軟件進(jìn)行圖像分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠體重

正常對(duì)照組大鼠體重隨飼養(yǎng)時(shí)間增加而增加，模型組大鼠體重也有增加，但相比正常對(duì)照組增長緩慢，且具有顯著性差異(P<0.01)；與模型組相比，辛伐他汀組、虎杖苷高劑量組的大鼠體重略有增加；但與正常對(duì)照組相比，無顯著性差異，結(jié)果見表1。

組別劑量/(mg·kg-1)體重/g給藥前4周8周12周正常對(duì)照212.5±13.0290.6±25.3314.3±18.0386.2±16.5模型 201.8±11.0217.9±16.6**225.4±15.0**230.2±10.4**辛伐他汀5199.7±8.9217.2±18.4229.6±14.6241.8±20.6#虎杖苷 160206.7±13.0220.3±15.6228.0±19.0241.9±20.8虎杖苷 80210.0±11.6216.2±15.7224.0±7.8228.2±15.7虎杖苷 40204.6±11.8225.6±16.2228.1±8.9224.5±15.9

注：與正常對(duì)照組相比：* *P<0.01；與模型組相比：#P<0.05

3.2 大鼠血脂

結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中的TC、TG、LDL-C明顯升高(P<0.01)，而血清中的HDL-C含量卻明顯降低(P<0.01)，與正常對(duì)照組相比，具有顯著性差異；與模型相比，虎杖苷組中大鼠血清TC、TG、LDL-C明顯降低，HDL-C明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且具有一定劑量相關(guān)性，結(jié)果見表2。

組別劑量/(mg·kg-1)TG/(mmol·L-1)TC/(mmol·L-1)LDL/(mmol·L-1)HDL/(mmol·L-1)正常對(duì)照0.538±0.100**1.542±0.100**0.554±0.091**1.403±0.144**模型1.940±0.0862.782±0.2671.432±0.1130.886±0.056辛伐他汀51.814±0.076**2.492±0.321*0.803±0.116**1.329±0.167**虎杖苷1601.753±0.078**2.256±0.099**0.874±0.046**1.298±0.110**虎杖苷801.814±0.089**2.524±0.104*1.084±0.040**1.004±0.111*虎杖苷401.831±0.089*2.608±0.1181.298±0.108*0.968±0.114

注：與模型組比較：**P<0.01，*P<0.05。

3.3 大鼠肝臟形態(tài)學(xué)觀察

肉眼條件下觀察：正常對(duì)照組大鼠肝臟為均勻暗紅色，具光滑質(zhì)感。模型組肝臟為黃褐色，具油膩質(zhì)感。辛伐他汀與虎杖苷各劑量組的肝臟形態(tài)改變不明顯。HE染色后置光鏡下觀察：正常對(duì)照組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)正常，可見放射狀肝索排列整齊，胞核清晰可見，脂肪變性與炎癥細(xì)胞浸潤病變不明顯；模型組大鼠肝臟脂肪變性明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)呈破壞狀，肝索排列不規(guī)則，肝細(xì)胞腫脹明顯，有大量脂肪積累在細(xì)胞中；辛伐他汀組與虎杖苷高、中劑量組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性輕微，脂滴、空泡樣變少見，結(jié)果見圖1。

正常對(duì)照組 模型組 辛伐他汀5mg·kg-1

虎杖苷160mg·kg-1 虎杖苷80mg·kg-1 虎杖苷40mg·kg-1圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)觀察(HE染色×200)Fig.1 Histopathological observation of livers in each group(HE staining×200)

3.4 大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞CD36的表達(dá)

造模后12周，模型組CD36 表達(dá)水平明顯升高；辛伐他汀組、虎杖苷高、中劑量組中大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞CD36 表達(dá)水平明顯降低，與模型組相比，有顯著性差異(P<0.01)；虎杖苷低劑量組CD36 表達(dá)水平有所降低，但與模型組相比，差異不明顯。結(jié)果見表3。

組別劑量/(mg·kg-1)平均光密度值正常對(duì)照5306±368**模型 9128±336辛伐他汀56086±656**虎杖苷 1606465±384**虎杖苷 806912±368**虎杖苷 408034±464

注：與模型組比較，**P<0.01

3.5 大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞血管細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)的表達(dá)

造模后12周，模型組VCAM-1表達(dá)明顯升高;辛伐他汀組、虎杖苷高、中劑量組中大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1表達(dá)水平明顯降低，與模型組相比，有顯著性差異(P<0.01)；虎杖苷低劑量組VCAM-1表達(dá)水平有所降低，但與模型組相比，差異不明顯。結(jié)果見表4。

組別劑量/(mg·kg-1)平均光密度值正常對(duì)照5806±472**模型 9203±312辛伐他汀56406±762**虎杖苷 1606615±376**虎杖苷 807142±382**虎杖苷 408834±476

注：與模型組比較：**P<0.01

4 討論

大量研究表明，血漿TC、TG、LDL-C水平過高對(duì)AS的形成和發(fā)展有促進(jìn)作用，而高水平的HDL-C可抑制AS的形成和發(fā)展[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，虎杖苷高、中劑量可明顯降低血清TC、TG、LDL-C水平，顯著升高血清HDL-C水平，可明顯改善、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝失調(diào)；組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，虎杖苷可減少膽固醇蓄積，避免肝臟脂肪沉積，防止肝臟彌漫性脂質(zhì)病變。VCAM-1表達(dá)于動(dòng)脈內(nèi)皮表面[3]，其主要作用是促使單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附[4]，從而促進(jìn)AS的形成和發(fā)展：在VCAM-1介導(dǎo)作用下，單核細(xì)胞黏附血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)入動(dòng)脈內(nèi)膜，繼而分化成巨噬細(xì)胞，在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中發(fā)揮了極其重要的作用；清道夫受體CD36分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，是主要的ox-LDL受體[5]，其作用是內(nèi)吞ox-LDL，形成泡沫細(xì)胞，影響泡沫細(xì)胞移動(dòng)，進(jìn)而觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成斑塊。在AS的早期病變程中，CD36參與了泡沫細(xì)胞的形成、炎癥介質(zhì)的釋放和血栓的形成[6]，它的表達(dá)影響泡沫細(xì)胞形成及斑塊內(nèi)脂質(zhì)的沉積，進(jìn)而影響斑塊的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)通過以高脂飼料喂養(yǎng)建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，考察虎杖苷對(duì)大鼠血管內(nèi)皮表面VCAM-1和CD36表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，虎杖苷能夠抑制AS大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1和CD36表達(dá)。提示虎杖苷能夠抑制VCAM-1參與的單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，減少清道夫受體參與的巨噬細(xì)胞內(nèi)吞，減少泡沫細(xì)胞形成，防止動(dòng)脈粥樣硬化早期形成動(dòng)脈斑塊，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

本課題組的另一研究結(jié)果表明，虎杖苷能平衡血脂代謝、干預(yù)炎癥反應(yīng)與調(diào)節(jié)NO的產(chǎn)生，抑制ox-LDL形成，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：虎杖苷能抑制AS模型大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM-1和CD36的表達(dá)，抑制VCAM-1參與的細(xì)胞黏附，對(duì)抗CD36介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)吞過程，發(fā)揮對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠AS的干預(yù)作用。綜合以上結(jié)果提示，虎杖苷具有干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的形成與發(fā)展作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)VCAM-1和CD36的表達(dá)有關(guān)，具體機(jī)制還需深入探討，其干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化作用值得進(jìn)一步研究。