封 芬，譚安雄，鄧集湘，周 斌

(1.邵陽學(xué)院 藥學(xué)院，湖南 邵陽，422000； 2.邵陽市中心醫(yī)院，湖南 邵陽，422000)

關(guān)健詞：黃連素；糖尿??；大血管病變；PI3K；Akt

文獻資料顯示，我國已成為世界第一糖尿病大國，2013年，成人糖尿病患病率已高達10.4%[1]。糖尿病大血管病變是指由糖尿病并發(fā)的心、腦血管及外周血管病變，接近65%的2型糖尿病患者死于大血管病變，其病理變化主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮功能異常和動脈粥樣硬化[2]。黃連素(Berberine)是我國傳統(tǒng)中藥，近年來發(fā)現(xiàn)其具有顯著的降血糖、降血脂、改善胰島素抵抗等功效[3-5]。據(jù)報道，黃連素可抑制兔頸動脈球囊損傷后新生內(nèi)膜增生，改善血管內(nèi)皮功能，發(fā)揮對血管內(nèi)皮的保護作用[6]。但目前國內(nèi)外文獻中，關(guān)于黃連素對糖尿病大血管保護作用的機制研究鮮有報道。近年研究顯示，PI3K/Akt信號通路參與了胰島素信號的傳遞，高濃度葡萄糖能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞Akt和eNOS mRNA表達[7]。故推測黃連素有可能通過PI3K/Akt信號通路參與糖尿病大血管的保護作用，本實驗通過研究黃連素對糖尿病大血管病變PI3K/Akt信號通路的影響，為黃連素防治糖尿病大血管病變發(fā)生發(fā)展提供理論基礎(chǔ)及實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及飼料

雄性SD大鼠60只，體重180～200克，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2016-0002；普通飼料(粗脂肪7.5%、粗蛋白24.3%、碳水化合物46.5%)；高脂飼料(含1%膽酸、2.5%膽固醇、10%煉豬油、20%蔗糖、66.5%普通飼料)購自湖南長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 藥物與試劑

鏈脲佐菌素(STZ)及黃連素(北京北實縱橫科技發(fā)展有限公司)；二甲雙胍(山東東方福瑞達制藥有限公司)；C反應(yīng)蛋白ELISA檢測試劑盒(北京華夏遠洋科技有限公司)；p-PI3Kp85一抗(Cell Signaling Technology公司)；p-Akt(Ser473)一抗、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)；β-actin抗體、PVDF膜(北京索萊寶科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)，化學(xué)發(fā)光試劑盒(Santa Cruz公司)。

1.3 主要儀器

Sure Step Plus血糖儀(Lifescan公司)，聚丙烯酰胺垂直電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、Elx800酶免疫儀(Bio Rad公司)，高速冷凍離心機(Eppendorf公司)，超低溫冰箱(三洋公司)，Chemi-Doc-IT610化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(UVP公司)。

1.4 動物造模及分組

清潔級雄性SD大鼠60只，隨機抽選10只作為正常組，飼喂普通飼料，其余大鼠飼喂高脂飼料。4周后，高脂飼料組大鼠禁食12h后腹腔注射STZ(30mg·kg-1，用pH4.4的0.1mol·L-1檸檬酸緩沖液溶解)，7天后重復(fù)注射一次。正常組在同等情況下腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液。2周后，斷尾取血檢測禁食12h后的空腹血糖(FBG)，以FBG≥7.8mmol·L-1為2型糖尿病大鼠造模成功的標準[8]。將造模成功的大鼠(n=30)隨機平均分為模型組、黃連素組和二甲雙胍組。模型組以生理鹽水灌胃(10ml·kg-1·d-1)，黃連素組以黃連素灌胃(150mg·kg-1·d-1)，二甲雙胍組以二甲雙胍灌胃(200mg·kg-1·d-1)，繼續(xù)喂養(yǎng)8W。

1.5 標本收集

藥物干預(yù)結(jié)束后，剪尾采血檢測FBG。然后腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(40mg·kg-1)麻醉大鼠，腹主動脈取血4～5ml，低溫高速離心后取血清，于-80℃保存。取血之后立即分離胸主動脈，剪成兩段，分別于HE染色和-80℃保存。

1.6 空腹血糖及血清C反應(yīng)蛋白的檢測

用血糖儀檢測大鼠FBG，按試劑盒說明書操作步驟檢測血清C反應(yīng)蛋白(CRP)水平。

1.7 形態(tài)學(xué)觀察

將大鼠胸主動脈用10%中性甲醛固定24h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，浸蠟，石蠟包埋，按4μm厚度連續(xù)切片，HE染色，光鏡下察看其形態(tài)學(xué)變化。

1.8 胸主動脈p-PI3Kp85、p-Akt表達檢測

取大鼠胸主動脈，加入RIPA裂解液(10μl·mg-1)和PMSF(1μl·mg-1)，于冰浴條件下勻漿，而后4℃，12000r·min-1離心5min，去除沉淀，按BCA試劑盒操作檢測蛋白總量。取50μg蛋白加入上樣緩沖液，加熱變性，然后在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳(濃縮膠為80V恒壓，分離膠為120V恒電)。半干式電轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，在室溫下輕搖2h后加入一抗4℃孵育過夜。次日TBST洗膜3次后(每次10min)加入二抗，37℃孵育45min。經(jīng)TBST洗膜3次后(每次20min)，于暗房內(nèi)加ECL發(fā)光劑，曝光、顯影、成像。用Image J圖像分析軟件分析免疫印跡結(jié)果，以β-actin蛋白灰度值為參考，計算p-PI3Kp85、p-Akt的相對含量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

實驗期間，正常組大鼠生長良好，毛皮光澤，自主活動正常，無死亡。模型組大鼠毛皮枯黃，萎靡少動，飲食飲水增加，小便排泄增多。黃連素組及二甲雙胍組大鼠用藥干預(yù)后，糖尿病癥狀明顯減輕，精神狀態(tài)良好，皮毛潤澤，自主活動無異常。

2.2 大鼠FBG及血清CRP水平

與正常組比較，模型組FBG及CRP水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，黃連素組及二甲雙胍組FBG及CRP水平明顯降低(P<0.01)。黃連素組與二甲雙胍組的FBG及CRP水平無統(tǒng)計學(xué)差異,見表1。

組別劑量/(mg·kg-1)FBG/mmol·L-1CRP/mg·L-1正常組 —4.62±0.291.34±0.11模型組 —13.54±0.21*2.78±0.18*二甲雙胍組2008.01±0.42△1.88±0.14△黃連素組 1508.9±0.38△1.91±0.15△

注：與正常組比較，*P<0.01，與模型組比較，△P<0.01

2.3 大鼠胸主動脈內(nèi)皮形態(tài)學(xué)觀察

正常組胸主動脈內(nèi)膜光滑平整，中膜層平滑肌細胞排列整齊。模型組內(nèi)膜斷裂不平整，連接間隙增大，內(nèi)皮細胞有壞死脫落。與模型組相比，黃連素組及二甲雙胍組各層細胞排列較規(guī)則，內(nèi)膜較光滑平整，內(nèi)皮細胞無壞死脫落，病變明顯減輕,見圖1。

注：A為正常組，B為模型組，C為二甲雙胍組，D為黃連素組圖1 黃連素對大鼠胸主動脈形態(tài)學(xué)的影響(HE染色，×200)Fig.1 The effect of berberine on the histological morphology of rats’ thoracic aorta by HE staining(×200)

2.4 大鼠胸主動脈p-PI3Kp85和p-Akt蛋白表達

免疫印跡結(jié)果顯示各蛋白與β-actin的分析光密度平均比值中，與正常組相比，模型組胸主動脈p-PI3Kp85、p-Akt的表達明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，黃連素組和二甲雙胍組胸主動脈p-PI3Kp85、p-Akt的表達明顯增高(P<0.01)；黃連組和二甲雙胍組p-PI3Kp85、p-Akt的表達無統(tǒng)計學(xué)差異，見圖2。

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01圖2 黃連素對大鼠胸主動脈p-PI3Kp85和p-Akt蛋白表達的影響±s，n=10)Fig.2 The effects of berberine on protein expression of p-PI3K p85 and p-Akt by western blot analysis in rats’aorta(±s，n=10).*P<0.01vs normal group;△P<0.01vs model group

3 討論

糖尿病血管并發(fā)癥主要表現(xiàn)為全身的血管損害，包括微血管病變和大血管病變，是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥。糖尿病血管并發(fā)癥的嚴重程度直接關(guān)系到糖尿病患者的預(yù)后及生活質(zhì)量。因此，深入研究糖尿病大血管病變的發(fā)生機制，對于控制和延緩其病理過程意義重大。本實驗采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)，結(jié)合小劑量STZ腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型[8]。此種造模方法操作較為方便，成模時間較短，可重復(fù)性較好，廣泛用于2型糖尿病發(fā)病機理的相關(guān)研究。在實驗期間模型組大鼠出現(xiàn)了典型的多食、多飲、多尿等糖尿病癥狀，黃連素組應(yīng)用黃連素灌胃治療干預(yù)后，上述癥狀明顯減輕。

黃連素又稱為小檗堿，屬于異喹啉類生物堿，可從中藥黃連、黃柏等提取，臨床上一直作為非處方藥用于治療腹瀉。近年來，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)黃連素在內(nèi)分泌、心血管及中樞神經(jīng)系統(tǒng)顯示出有益的藥理活性及功效[9]。據(jù)報道，黃連素能顯著降低空腹血糖，通過抑制肝糖異生作用，改善糖尿病大鼠糖代謝[10]。Wang J等發(fā)現(xiàn)，黃連素短期應(yīng)用可通過局部抑制腸DPP-Ⅳ而降低STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型FBG及餐后2h血糖[11]。本實驗結(jié)果顯示黃連素組大鼠FBG水平明顯低于糖尿病組，說明黃連素灌胃治療干預(yù)后，能有效降低2型糖尿病大鼠空腹血糖(P<0.01)，與國內(nèi)外報道一致。

C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CPR)是一種非糖基化的聚合蛋白，它的生物學(xué)作用主要包括識別和結(jié)合內(nèi)源性異物、激活補體、調(diào)節(jié)吞噬細胞活性等，為非特異性的炎癥標記物，是炎癥急性期時最靈敏的指標之一。Lowe G等認為，炎癥因子水平紊亂是引起血管內(nèi)皮細胞功能損傷的重要誘因[12]。研究表明，血清CRP水平與糖尿病大血管病變之間存在著明顯的相關(guān)性，高血糖及高血脂可通過增加血管內(nèi)皮細胞通透性，引起內(nèi)皮功能損傷，使CRP等相關(guān)炎癥因子水平紊亂[13]。據(jù)報道，黃連素對軟脂酸引起的血管內(nèi)皮細胞損傷有顯著的保護作用，并可能與上調(diào)eNOS、促進NO生成有關(guān)[14]。諸多研究顯示，黃連素在保護血管方面有積極意義。本實驗結(jié)果中，模型組大鼠血清CRP水平顯著增高(P<0.01)，HE染色顯示大鼠胸主動脈內(nèi)膜受損，提示糖尿病模型大鼠大血管出現(xiàn)炎性病變。黃連素組用黃連素干預(yù)治療8周后，大鼠血清CRP水平明顯低于模型組(P<0.01)，胸主動脈內(nèi)膜病變也輕于模型組，提示黃連素能有效減輕血管炎性反應(yīng)，在防治糖尿病大血管病變方面有積極作用。

磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)信號通路參與細胞膜轉(zhuǎn)運、分泌和細胞生存、代謝、凋亡等多種細胞功能的調(diào)控。PI3K是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成的異二聚體[15]，調(diào)節(jié)亞基p85結(jié)合磷酸化的酪氨酸殘基之后，活化催化亞基p110，從而傳導(dǎo)酪氨酸激酶信號。Akt(蛋白激酶B)是PI3K信號通路下游的重要靶蛋白，PI3K/Akt信號通路在胰島素調(diào)控血糖平衡方面發(fā)揮著重要作用[16]。研究表明，糖尿病患者Akt活化受損，黃癸固體分散體中的有效成份黃連素能上調(diào)Akt活性，促進葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4膜轉(zhuǎn)位，改善胰島素抵抗[17]。徐明國等報道，黃連素抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細胞損傷與激活PI3K/AKT/eNOS途徑有關(guān)[18]。本實驗結(jié)果顯示，模型組胸主動脈p-PI3Kp85、p-Akt的表達明顯低于正常組(P<0.01)，而黃連素組用黃連素灌胃治療8周后，p-PI3Kp85、p-Akt的表達明顯高于模型組(P<0.01)?；谙嚓P(guān)文獻報道和本實驗的初步研究結(jié)果認為，黃連素能降低2型糖尿病模型大鼠的空腹血糖，改善大血管病變的病理過程，對糖尿病大血管具有保護作用，此作用機制可能與上調(diào)PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

糖尿病大血管病變所涉及的信號通路錯綜復(fù)雜，本實驗僅初步探討了黃連素對糖尿病大鼠大血管PI3K/Akt信號通路的影響，其中各項指標間的因果聯(lián)系還待研究。此外，黃連素對糖尿病大血管的保護作用是否涉及到其他機制也需要進一步的探索，以期為2型糖尿病大血管病變的防治用藥提供更廣泛的思路空間。