林輝 王琳娜 文清 梁桂枝

[摘要]目的：探索對(duì)兔自體脂肪顆粒移植存活率有促進(jìn)作用的中藥注射液。方法：20只兔建立自體脂肪顆粒移植模型，隨機(jī)分為5組，各組分別肌肉注射生脈、刺五加、黃芪、參麥注射液及生理鹽水0.37ml/kg·d，90d后檢測(cè)移植脂肪的質(zhì)量，計(jì)算移植脂肪存活率。結(jié)果：術(shù)后90d，4種中藥組移植存活率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），生脈組移植成活率較高（P<0.05）。4種中藥組血清VEGF表達(dá)水平在移植術(shù)后1周、3周和6周均明顯高于對(duì)照組，生脈組顯著高于其它3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；4種中藥組毛細(xì)血管密度均較對(duì)照組明顯增高，生脈組高于其它3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：0.37ml/kg·d劑量時(shí)，4種中藥都可提高自體脂肪顆粒移植存活率，但是生脈的作用最強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞]中藥；生脈注射液；黃芪注射液；參麥注射液；刺五加注射液；自體脂肪移植；存活率

[中圖分類號(hào)]R622+.9 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）05-0115-03

Effects of Traditional Chinese Medicine Injection on the Survival Rate of

Autologous Fat Grafting

LIN Hui，WANG Lin-na，WEN Qing，LIANG Gui-zhi

（Department of Laser and Plastic Surgery，the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530022，Guangxi，China）

Abstract： Objective To explore the traditional chinese medicine to promote the survival rate of autologous fat grafting in rabbits. Methods Twenty rabbits were randomly divided into five groups. The groups were given different doses of shengmai， ciwujia， huangqi， shenmai and normal saline by intramuscular injection. Ninety days later， the survival weight of the fat grafts were detected and the survival rates were calculated. Results The survival rates of the four Chinese medicine groups were higher than that of the control group after 90d， the differences were statistically significant（P<0.05）. The survival rate of the grafts in the Shengmai group was higher than that of the other three groups（P<0.05）. The level of serum VEGF in the four Chinese medicine groups were significantly higher than that of the control group at 1 week， 3 weeks and 6 weeks after transplantation， and the Shengmai group was significantly higher than that of the other three groups（P<0.05）. The capillary density of the four Chinese medicine groups were significantly higher than that of the control group， and the Shengmai group was higher than the other three groups（P<0.05）. Conclusion The survival rate of autologous fat grafting was improved by the four kinds of chinese medicine， but the effect of shengmai injection was the strongest at this dose of 0.37ml/kg·d.

Key words： traditional chinese medicine； shengmai injection； huangqi injection； shenmai injection； ciwujia injection； autologous fat grafting； survival rate

自體脂肪組織作為理想的軟組織填充物，具有取材容易、無(wú)免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)。但注射脂肪存在著吸收率較高的問(wèn)題，嚴(yán)重影響了自體脂肪移植效果[1-2]。生脈、刺五加、黃芪、參麥均具有活血化淤，改善微循環(huán)、保護(hù)細(xì)胞等功效。為了探討中藥對(duì)脂肪移植成活率的影響，本實(shí)驗(yàn)研究肌肉注射這4種中藥對(duì)兔自體脂肪顆粒移植成活率的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料：生脈注射液（四川川大華西藥業(yè)股份有限公司），刺五加注射液（黑龍江烏蘇里江制藥有限公司），黃芪注射液（上海福達(dá)制藥有限公司），參麥注射液（四川升和藥業(yè)股份有限公司），VEGF的ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。新西蘭大白兔20只（廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體質(zhì)量2.5～3.0kg。

1.2 自體脂肪移植模型的建立：兔全麻后，固定于手術(shù)臺(tái)上，刮除腹股溝及雙耳背部皮毛。常規(guī)消毒鋪巾，于腹股溝處取出腹股溝脂肪約2.5ml。剪碎，生理鹽水沖洗，獲得直徑1～2mm的脂肪顆粒。將脂肪顆粒吸入1ml注射器內(nèi)，用16G注脂針?lè)謩e注入雙耳背部皮下共4處，每處0.5ml。

1.3 分組：20只兔隨機(jī)分成5組，分別給予肌肉注射生脈、刺五加、黃芪、參麥注射液和生理鹽水0.37ml/kg·d，均持續(xù)用藥2周。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè)：術(shù)后90d進(jìn)行脂肪移植物標(biāo)本取材，完整取下脂肪移植物，剪去周圍組織及包膜，精密天平準(zhǔn)確測(cè)量其質(zhì)量。測(cè)得移植物存活率=移植后樣本質(zhì)量/移植前質(zhì)量×100%。移植物稱量后置入4%多聚甲醛固定24h，流水沖洗過(guò)夜。乙醇梯度脫水后，將標(biāo)本置于透明二甲苯中浸泡，浸蠟后，進(jìn)行包埋，行HE染色及血管內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子免疫組化染色。脂肪移植術(shù)后1周、3周、6周于耳緣靜脈采血，每只采血1ml，以1 500r/min離心5min后，取上層血清，-80℃冰箱保存，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清VEGF表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，存活率比較采用卡方檢驗(yàn)，VEGF表達(dá)和毛細(xì)血管密度采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)動(dòng)物死亡，耳背皮下可見(jiàn)丘狀隆起的脂肪移植物。均未見(jiàn)脂肪液化、壞死、空腔或膿腫形成。脂肪移植體均表現(xiàn)為質(zhì)地柔軟、邊界較清晰、活動(dòng)度良好的組織團(tuán)塊，脂肪移植體均呈暗黃色，外部被一層纖維組織包膜覆蓋，界線比較明顯。大體觀察可見(jiàn)4種中藥組脂肪組織移植物體積均大于對(duì)照組，刺五加、黃芪和參麥3組差別不大，但生脈組稍大于刺五加、黃芪和參麥組。

2.2 五組移植脂肪存活率及血清VEGF表達(dá)情況：術(shù)后90d，4種中藥組移植存活率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但生脈組自體脂肪顆粒移植成活率較高，與其它3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。4種中藥組血清VEGF表達(dá)水平在移植術(shù)后1周、3周和6周均明顯高于對(duì)照組（P<0.05），生脈組顯著高于其它3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 組織學(xué)觀察：HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組移植脂肪組織中有較多脂肪細(xì)胞融合，存活脂肪細(xì)胞大小不規(guī)則，分布不均勻，脂肪組織間纖維結(jié)締組織較多，血運(yùn)不豐富，新生血管不明顯。刺五加、黃芪和參麥3組脂肪細(xì)胞存活較好，新生脂肪細(xì)胞排列比較整齊，新生血管較豐富，但各組間差別不明顯。生脈組脂肪細(xì)胞存活最好，新生脂肪細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則，分布均勻，脂肪小葉以及脂肪小葉間纖維組織保持較好，周圍新生血管豐富。見(jiàn)圖1。

2.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：血管內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子免疫組化染色后，血管呈現(xiàn)棕黃色。對(duì)照組移植脂肪組織血運(yùn)不豐富，新生血管不明顯。刺五加、黃芪和參麥3組移植脂肪組織周邊區(qū)和中心區(qū)血管均較豐富，但生脈組移植脂肪組織周邊區(qū)和中心區(qū)血管更豐富。見(jiàn)圖2。

2.5 毛細(xì)血管密度檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組移植脂肪組織毛細(xì)血管密度為（13.06±6.64）條/HP，刺五加組為（20.16±3.24）條/HP，黃芪組為（20.32±3.34）條/HP，參麥組為（20.61±3.32）條/HP，生脈組為（24.98±9.23）條/HP，4種中藥組毛細(xì)血管密度均較對(duì)照組明顯增高（P<0.05），生脈組高于其它3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

為了提高移植脂肪存活率，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行各種探索：選擇不同脂肪供區(qū)、降低抽吸與注射時(shí)壓力等方法，取得了一定的效果，但遠(yuǎn)期吸收率仍然較高[3-4]。移植早期及時(shí)建立血供，移植物及時(shí)地再血管化是影響其成活的關(guān)鍵。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）具有較強(qiáng)的有絲分裂活性，有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、延長(zhǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞壽命等作用。VEGF可促進(jìn)移植脂肪的血運(yùn)重建，有效地提高移植脂肪存活率[5-7]。中醫(yī)學(xué)有“氣能生血”、“氣能行血”、“補(bǔ)氣活血”、“活血化瘀”等理論，隨著對(duì)中藥藥理機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)中藥不僅有改善微循環(huán)，保護(hù)細(xì)胞，還有促進(jìn)血管生成的作用[8]。

刺五加注射液為五加科植物刺五加的莖葉經(jīng)水醇法提取精制而成， 能“補(bǔ)中益氣， 強(qiáng)筋骨”。刺五加注射液能擴(kuò)張血管，促進(jìn)和改善微循環(huán)，降低血小板聚集功能，降低血液粘稠度，減少組織耗氧量，降低組織代謝，增加組織對(duì)乏氧的耐受性，提高人體超氧化物歧化酶活性及清除氧自由基的能力[9]。研究證實(shí)，刺五加皂苷可改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，促進(jìn)血管新生，可能與刺激VEGF進(jìn)一步表達(dá)有關(guān)[10]。

黃芪是最常用的益氣中藥之一，益氣不僅能生血，還能生絡(luò)。黃芪有明顯的促心肌梗死大鼠損傷心肌組織血管新生的作用，其機(jī)制可能是提高了CD34和VEGF的表達(dá)，引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增多和新管腔形成[11]。黃芪注射液能促進(jìn)兔VEGF表達(dá)，使新生血管增加，提高移植脂肪存活率[12]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

參麥注射液的主要成分為紅參、麥冬，具有益氣固脫、補(bǔ)心復(fù)脈、養(yǎng)陰生津之功效。主治冠心病、病毒性心肌炎和各類急重癥等。參麥能促進(jìn)VEGF分泌，抑制心肌缺血時(shí)脂質(zhì)過(guò)氧化，促進(jìn)氧自由基清除，加快兔缺血心肌血管內(nèi)皮新生[13]。參麥能促進(jìn)大鼠缺血心肌血管內(nèi)皮再生，對(duì)改善再灌注損傷血管內(nèi)皮功能紊亂有一定的防治作用[14]。

生脈注射液具有理氣開(kāi)竅、生津復(fù)脈、扶正祛邪、活血化瘀等作用。生脈注射液可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO，保護(hù)血管內(nèi)皮功能，并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF，促進(jìn)血管新生增多，降低炎癥反應(yīng)[15]。生脈注射液能降低血清丙二醛而提高超氧化物歧化酶的活力，提供細(xì)胞保護(hù)作用[16]。生脈注射液具有耐缺氧、復(fù)氧損傷保護(hù)、促進(jìn)血管新生等作用[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自體脂肪移植術(shù)后90d，中藥4組的存活率均高于對(duì)照組，提示4種中藥注射液均能提高自體移植脂肪的存活率。HE切片染色及免疫組織化學(xué)染色觀察顯示，脂肪細(xì)胞大小與形態(tài)、新生毛細(xì)血管數(shù)量、移植脂肪組織纖維化程度等方面，中藥4組均優(yōu)于對(duì)照組，刺五加、黃芪和參麥3組差別不明顯，生脈組稍好于其他3組。提示中藥注射液可以增加移植脂肪組織內(nèi)血供，加速移植物新生血管的形成，從而增加自體脂肪移植存活率和質(zhì)量。中藥4組的血清VEGF表達(dá)水平在移植術(shù)后第1、3、6周與對(duì)照組比較均有明顯增高，可能是中藥制劑在移植術(shù)后的早期發(fā)揮了擴(kuò)張微小動(dòng)脈和改善微循環(huán)的作用，同時(shí)上調(diào)了血清VEGF的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)提示中藥在細(xì)胞保護(hù)、抗氧化和改善脂肪內(nèi)部血供及微循環(huán)、誘導(dǎo)血管新生、血運(yùn)重建方面均發(fā)揮了重要的作用。就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言，在0.37ml/kg·d劑量時(shí)，生脈提高自體脂肪移植的存活率作用略佳。

中藥注射液用藥方法推薦肌肉注射、靜脈注射及靜脈輸液，本實(shí)驗(yàn)采用肌肉注射主要是用藥時(shí)操作簡(jiǎn)單，但是這4種中藥局部應(yīng)用是否也有相應(yīng)作用，以及這4種中藥中哪一成分有促進(jìn)VEGF表達(dá)還有待進(jìn)一步研究，還有中藥組合應(yīng)用是否更有利于提高自體脂肪移植的存活率，尚待深入研究。

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[收稿日期]2018-01-22 [修回日期]2018-03-12

編輯/朱婉蓉