張奇文，凌晨，杜冬冬，錢凌霄，李紅歡，薄新文，馬勛

（1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)墾科學(xué)院,新疆 石河子832003）

單增李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一種能引起人和動(dòng)物發(fā)病的重要食源性人畜共患病病原菌，廣泛存在于自然界，如河水、污泥、食品、屠宰場(chǎng)棄物、動(dòng)物、青貯料、土壤等[1]，其具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，可在低溫、高鹽、酸堿等不利的環(huán)境條件下生長(zhǎng)繁殖[2]。LM可穿越宿主腸道屏障、胎盤屏障、血腦屏障，入侵宿主機(jī)體后在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞內(nèi)存活并大量增殖[3]。引起腸胃炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等癥狀，尤其是對(duì)新生兒、妊娠母畜和免疫功能不全者，其發(fā)病率和死亡率均較高[4]。該菌是世界衛(wèi)生組織 (World Health Organization，WHO)列為僅次于大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌后的第四大重要的食源性致病菌[5]，成為許多國(guó)家食品衛(wèi)生的必檢項(xiàng)目之一。

LM有一類表面蛋白，其前體蛋白C端含有保守基序 LPXTG(Leu-Pro-X-Thr-Gly)，這些蛋白由分選酶Sort A通過(guò)識(shí)別LPXTG保守基序，將蛋白共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞壁肽聚糖上，呈現(xiàn)在細(xì)胞表面，在感染機(jī)體過(guò)程中發(fā)揮重要毒力作用[6]。蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)[7]，標(biāo)準(zhǔn)菌株含有41個(gè)LPXTG保守基序蛋白，但目前僅有部分蛋白的功能被研究，如：InlA蛋白可通過(guò)N末端的LRR區(qū)和其后連接的IR區(qū)介導(dǎo)LM粘附腸道上皮，通過(guò)表面特異性受體E-鈣粘素介導(dǎo) LM侵入機(jī)體[8]；Kirchner等[9]研究發(fā)現(xiàn)，LM可通過(guò) InlF蛋白介導(dǎo)作用抑制宿主細(xì)胞中的ROCK激酶的活性，進(jìn)而增強(qiáng)LM對(duì)細(xì)胞的粘附與侵襲能力；Christophe等[10]利用基因缺失的方法研究inlJ基因功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，LM缺失inlJ基因后毒力大幅降低；Lmo2085蛋白可使LM在胞內(nèi)具有運(yùn)動(dòng)能力，促進(jìn)細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞和躲避機(jī)體的免疫應(yīng)答[11]；Lap B蛋白具有黏附功能，可通過(guò)其N端結(jié)構(gòu)域與宿主細(xì)胞受體相互作用，Sievers等[12]進(jìn)一步驗(yàn)證了LM缺失lap B基因后其毒力減弱。

目前，對(duì)LPXTG基序蛋白Lmo0159蛋白的研究主要針對(duì)其分子結(jié)構(gòu)特征方面，而對(duì)該蛋白在參與調(diào)控LM毒力及環(huán)境應(yīng)激方面發(fā)揮的具體作用并未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬利用SOE-PCR及同源重組技術(shù)構(gòu)建 LM90SB2-Δlmo0159缺失株，并對(duì)野生株和lmo0159基因缺失株在不同脅迫環(huán)境的適應(yīng)能力進(jìn)行了研究，以期為進(jìn)一步了解LM環(huán)境耐受性及其致病性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

LM90SB2是新疆致綿羊腦炎單增李斯特菌分離株，由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存，血清型為4b型；穿梭載體pKSV7由浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院分子微生物與食品安全衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存惠贈(zèng)；pMD19-T(Simple)載體購(gòu)自大連寶生物(Takara)公司；大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑

質(zhì)粒小提取試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司(北京)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京諾維森生物科技有限公司；DNA Marker、Pfu DNA 高保真聚合酶、dNTPs均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×PCR Mix購(gòu)自上海東盛公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、PstⅠ、T4 DNA連接酶均購(gòu)自Promega生物技術(shù)有限公司(上海)；氨芐青霉素、氯霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BHI培養(yǎng)基購(gòu)自海博生物技術(shù)有限公司(青島)，胰蛋白胨，酵母粉等購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 主要儀器

SG403TX型生物安全柜，美國(guó)Baker公司；HITACHI型CR22E高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；GH600BC型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京永光明醫(yī)療儀器廠；ArKtiK型PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)Thermo公司；GEIDOCXR型電泳凝膠成像儀和165-2089型電轉(zhuǎn)化杯，美國(guó)Bio-Rad公司；Electroporator2510型電轉(zhuǎn)儀，德國(guó)EPPENDORF公司；PH211C型精密數(shù)顯酸度計(jì)，意大利哈納公司；POWER WAVE XS型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)BIOTEK公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

參照 GenBank中公布的F2365菌株 (登錄號(hào)：AE017262)和EGD-e菌株的lmo0159基因序列(登錄號(hào)：AL591824)，應(yīng)用 Primer5.0軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增lmo0159基因上下游同源臂片段、驗(yàn)證缺失株以及LM的特異性引物，在lmo0159-F1和lmo0159-R2 5’端分別引入BamHⅠ和PstⅠ (斜體下劃線部分)和保護(hù)性堿基(斜體部分)(表1)，由上海生工有限公司合成。

表1 構(gòu)建LM90SB2 lmo0159基因缺失株特異性引物Tab.1 Specific primers for construction of lmo0159 gene deletion strain of LM90SB2

1.2.2 lmo0159基因上、下游臂片段的擴(kuò)增

以細(xì)菌DNA提取試劑盒提取的LM90SB2 DNA為模板，用Pfu DNA高保真聚合酶及l(fā)mo0159-F1和lmo0159-R1擴(kuò)增上游臂片段，lmo0159-F2和lmo0159-R2擴(kuò)增下游臂片段；25 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Pfu DNA 高保真聚合酶 1 μL，dNTPs 1 μL，DNA 模板 2 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O 16.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60.7 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠后，DNA回收試劑盒回收。

1.2.3 lmo0159基因同源臂融合、克隆及測(cè)序

以上述獲得的上下游同源臂為模板進(jìn)行第一步融合后，再以lmo0159-F1和lmo0159-R2引物通過(guò)SOE-PCR方法進(jìn)行第二步融合，獲得lmo0159基因缺失盒Δlmo0159。具體步驟如下：第一步融合，采用20 μL 反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs 2.5 μL，上下游同源臂各 3 μL，Tap DNA聚合酶 0.5 μL，ddH2O 9 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，15個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。第二步融合，再加入lmo0159-F1和lmo0159-R2引物各0.5 μL擴(kuò)增片段全長(zhǎng)，反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后，與pMD19-T(Simple)載體連接，冷熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)菌液PCR篩選出陽(yáng)性克隆菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證成功后，送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確重組質(zhì)粒命名為pMD19-T-Δlmo0159。

1.2.4 pKSV7-Δmo0159重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

分別將pMD19-T-?lmo0159和pKSV7穿梭質(zhì)粒用BamHⅠ和PstⅠ置于37℃水浴中雙酶切，酶切3 h后，加入4 μL 10×Loading buffer終止酶切反應(yīng)，經(jīng)凝膠電泳驗(yàn)證正確后切膠回收目的條帶，利用T4 DNA連接酶將酶切后的Δlmo0159片段連入pKSV7載體；然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR(lmo0159-F1和lmo0159-R2)和雙酶切驗(yàn)證成功后，送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.5 電轉(zhuǎn)后陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選

參照文獻(xiàn)[13]制備單增李斯特菌LM90SB2感受態(tài)細(xì)胞。取10 μL pKSV7-Δlmo0159重組穿梭質(zhì)粒加入100μL LM90SB2感受態(tài)細(xì)胞中，并使之混勻后加到處理好的電轉(zhuǎn)杯中，冰浴10 min，電轉(zhuǎn)化(2.5 kV，5 ms)，加入 1 mL BHI(含 0.5 M 蔗糖)液體培養(yǎng)基，冰浴30 min后轉(zhuǎn)置30℃恒溫培養(yǎng)箱靜置3 h，8 000 r/min離心5 min，棄上清，剩余菌體涂布于BHI瓊脂平板 (含10 μg/mL氯霉素)，30 ℃培養(yǎng) 48 h，挑取單菌落置30℃過(guò)夜培養(yǎng)，通過(guò)菌液PCR(lmo0159-F1和lmo0159-R2)篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.2.6 同源重組及遺傳穩(wěn)定性鑒定

將上述鑒定的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于BHI液體培養(yǎng)基，在溫度(42℃)和氯霉素抗性(10 μg/mL)的雙重壓力下進(jìn)行同源重組。傳代培養(yǎng)25代后，挑單菌落，菌液PCR篩選出有氯霉素抗性的單交換重組菌。然后再在無(wú)氯霉素抗性BHI液體培養(yǎng)基中在30℃培養(yǎng)以丟失抗性質(zhì)粒，通過(guò)影印接種于抗氯霉素和不抗氯霉素BHI板篩選出無(wú)抗性的缺失株，再經(jīng)驗(yàn)證引物（lmo0159-A和lmo0159-B）和LM特異性引物（Hly-F和Hly-R）PCR進(jìn)一步鑒定。最終得到鑒定正確基因缺失株 LM90SB2-Δlmo0159。將獲得的重組缺失菌株在無(wú)抗性37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)25代，每間隔5代進(jìn)行菌液 PCR鑒定 LM90SB2-Δlmo0159的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.7 lmo0159基因缺失株對(duì)不同脅迫環(huán)境試驗(yàn)

分別挑取LM90SB2和LM90SB2-Δlmo0159單菌接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600nm≈0.4，以1∶100的比例分別接種于15 mL BHI液體培養(yǎng)基中，分別置于4、37和42℃恒溫細(xì)菌振蕩培養(yǎng)箱 (180 r/min)培養(yǎng)；以1∶100的比例分別接種于NaCl濃度為2.5%和4.5%，乙醇濃度為3.5%的15 mL BHI液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫細(xì)菌振蕩培養(yǎng)箱(180 r/min)培養(yǎng)，每間隔1.5或2 h，置全自動(dòng)酶標(biāo)儀中測(cè)定OD600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線，觀察并分析lmo0159基因缺失后對(duì)LM90SB2在不同環(huán)境脅迫下生長(zhǎng)能力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 lmo0159基因缺失片段的融合

本研究以lmo0159-F1和 lmo0159-R1、lmo0159-F2和lmo0159-R2為引物分別擴(kuò)增上、下游同源臂，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分別得到388和409 bp單一目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

SOE-PCR融合上、下游同源臂，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳得到長(zhǎng)為797 bp片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。經(jīng)測(cè)序、序列比對(duì)分析表明已成功缺失lmo0159基因序列。

圖1 lmo0159基因上下游同源臂PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Homologous arms amplified of lmo0159 gene by PCR

圖2 lmo0159 SOE-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Products amplification of lmo0159 by SOE-PCR

2.2 重組穿梭質(zhì)粒 pKSV7-Δlmo0159的構(gòu)建及鑒定

圖3 pMD19-T-lmo0159雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pMD19-T-lmo0159 by double enzyme digestion

Δlmo0159與pMD19-T(Simple)載體連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒pMD19-T-Δlmo015經(jīng)雙酶切鑒定得到了2692和797 bp條帶(圖3)，測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列分析比對(duì)后，與預(yù)期結(jié)果一致。將同步雙酶切膠回收后的Δlmo0159片段與pKSV7載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，將PCR篩選出陽(yáng)性菌液，提取質(zhì)粒pKSV7-Δlmo0159雙酶切鑒定得到6900和797 bp條帶(圖4)，結(jié)果均符合預(yù)期片段大小，表明重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-Δlmo0159成功構(gòu)建。

2.3 LM90SB2-Δlmo0159缺失株的篩選與鑒定

圖4 pKSV7-lmo0159雙酶切鑒定Fig.4 Identification of pKSV7-lmo0159 by double enzyme digestion

電轉(zhuǎn)后，以lmo0159-A和lmo0159-B為引物篩選出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子可擴(kuò)增得到2932和962 bp目的條帶 (圖5A)；42℃和氯霉素抗性的雙重壓力下傳代培養(yǎng)25代，PCR篩選得到只有1條962 bp的目的條帶，且含氯霉素抗性的單交換重組菌；30℃和無(wú)氯霉素抗性的條件下傳代培養(yǎng)25代，可獲得無(wú)氯霉素抗性和不含lmo0159基因(只含有1條962 bp條帶)的細(xì)菌，即表明成功構(gòu)建了LM90SB2-Δlmo0159缺失株(圖5 B)；37℃無(wú)抗性傳代培養(yǎng)25代，菌液PCR檢測(cè)顯示：Δlmo0159缺失株只能擴(kuò)增出962 bp單一條帶，LM90SB2野生株只能擴(kuò)增出2932 bp單一條帶，結(jié)果表明缺失條帶穩(wěn)定存在，得到了穩(wěn)定遺傳的lmo0159基因缺失株(圖5C)。

圖5 LM90SB2-lmo0159重組菌PCR檢測(cè)Fig.5 Identification of recombinant bacteria LM90SB2-lmo0159 by PCR

2.4 LM在不同脅迫環(huán)境的試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 不同溫度對(duì)LM生長(zhǎng)的影響

將LM90SB2和LM90SB2-Δlmo0159分別置于不同溫度條件下培養(yǎng)，測(cè)定OD600nm值繪制其生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示：2株菌在4℃生長(zhǎng)均極其緩慢，缺失株的生長(zhǎng)趨勢(shì)與野生株相同，表明lmo0159基因的缺失并未對(duì)野生株的耐寒特性造成明顯影響 (P＞0.05)；在37和42℃培養(yǎng)下生長(zhǎng)迅速，均在4 h之后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但隨著時(shí)間的推移，缺失株的生長(zhǎng)顯著低于野生株，差異顯著(P＜0.05)，尤其是42℃缺失株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期維持時(shí)間僅約4 h，而野生株長(zhǎng)達(dá) 6 h。(圖 6A-C)。

圖6 LM90SB2和LM90SB2-Δlmo0159在不同環(huán)境脅迫中的生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curves of LM90SB2 and LM90SB2-Δlmo0159 at different environmental stress

2.4.2 不同NaCl濃度對(duì)LM生長(zhǎng)的影響

野生株和缺失株在4.5%NaCl的BHI培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到明顯抑制(圖6E)，生長(zhǎng)差異不顯著(P＞0.05)；但在2.5%NaCl BHI中培養(yǎng)的結(jié)果顯示，缺失株的生長(zhǎng)在進(jìn)入對(duì)數(shù)期后顯著低于野生株，差異顯著(P＜0.05)(圖 6D)。

2.4.3 3.5%乙醇濃度對(duì)LM生長(zhǎng)的影響

在含有3.5%乙醇BHI中，野生株和缺失株的生長(zhǎng)均受到明顯抑制，但隨著時(shí)間的推移，缺失株的生長(zhǎng)能力較野生株顯著下降，差異顯著 (P＜0.05)(圖 6F)。

3 討論

LM是重要的人畜共患病病原菌，被 WHO列為重要的食源性致病菌之一[14]，受到許多國(guó)家的關(guān)注。毒力因子在LM致病過(guò)程中起關(guān)鍵作用 (包括內(nèi)化素、菌體蛋白Act A，李氏桿菌溶血素O，磷酸脂酶C，蛋白Cwh A和金屬蛋白酶等)[15]。LM表面存在多種形式并發(fā)揮功能作用的蛋白群，根據(jù)不同的錨定系統(tǒng)和潛在結(jié)構(gòu)域，將其分為四種，分別為L(zhǎng)PXTG表面蛋白、疏水性尾部蛋白、GW蛋白和脂蛋白[16]。隨著生物信息學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)技術(shù)的不斷深入，LPXTG基序蛋白的功能相繼報(bào)道。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Lmo0159蛋白具有1個(gè)膠原蛋白結(jié)合位點(diǎn)和3個(gè)Cna B結(jié)合位點(diǎn)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)是以無(wú)規(guī)則卷曲為主的混合型，在氨基酸生物合成、酶代謝、脂肪酸代謝、免疫應(yīng)答和脅迫應(yīng)答等方面發(fā)揮作用的幾率均較高。

本研究利用SOE-PCR及同源重組技術(shù)，通過(guò)自殺性重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化方法，成功構(gòu)建LM90SB2-Δlmo 0159基因缺失株，為進(jìn)一步研究lmo0159基因表達(dá)產(chǎn)物的功能奠定基礎(chǔ)。LM在1-45℃條件下均可生長(zhǎng)，其耐寒特性對(duì)食物保藏和公眾健康造成嚴(yán)重威脅[7]。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野生株和缺失株在4℃條件下的生長(zhǎng)均緩慢且無(wú)顯著差異 (P＞0.05)，但在42℃條件下2株細(xì)菌生長(zhǎng)迅速，但缺失株生長(zhǎng)速度明顯低于野生株(P＜0.05)，且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期縮短，表明lmo0159基因可能參與了LM對(duì)高溫環(huán)境的適應(yīng)。

高滲溶液使細(xì)菌的細(xì)胞失水收縮，胞質(zhì)溶質(zhì)濃度升高，使細(xì)菌細(xì)胞生物功能遭到破壞，從而生長(zhǎng)繁殖受到抑制。醇類物質(zhì)可侵入菌體細(xì)胞，破壞蛋白質(zhì)表面的水膜，使之失去活性，同時(shí)也破壞細(xì)菌蛋白質(zhì)的肽健，使之變性。有研究報(bào)道[17-19]，LM EGDe缺失rli87基因后在3.8%乙醇和10%高滲環(huán)境下生長(zhǎng)曲線與親本株無(wú)顯著差異；而缺失hfq基因后，無(wú)論是5%和7%高滲環(huán)境，還是3.5%和4.5%乙醇環(huán)境，LM-Δhfq的生長(zhǎng)均受到顯著抑制與親本株有顯著差異。本研究中野生株和缺失株的生長(zhǎng)在4.5%高滲環(huán)境下均受到抑制，生長(zhǎng)緩慢，但差異不顯著，但在2.5%高滲和3.5%乙醇環(huán)境下，野生株生長(zhǎng)正常，而缺失株的生長(zhǎng)受到顯著抑制，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生株，差異顯著，可見(jiàn)，缺失株對(duì)2.5%高滲和3.5%乙醇抵抗能力下降，表明lmo0159基因可能參與了LM對(duì)一定高滲環(huán)境和乙醇環(huán)境的適應(yīng)。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了單增李斯特菌LM90SB2-Δlmo 0159缺失株，對(duì)缺失株抗脅迫能力研究表明，lmo0159基因?qū)M抗高溫和一定程度的高滲和乙醇具有重要作用。