袁飛洲，舒凡帆，吳杰，李朝，石蓮琴，鄒豐才，楊建發(fā)*

（1西雙版納傣族自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 西雙版納 666100；2大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 大理 671003；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）是一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲，釘螺作為日本血吸蟲病唯一的中間宿主，對(duì)該病的流行傳播發(fā)揮媒介作用，因此，消滅釘螺是控制血吸蟲病主要的措施[1-2]。釘螺的外殼為右螺旋狀的圓錐形，去殼后為軟體組織，軟體組織前部主要包括頭、頸和足，以及外套膜，后面是內(nèi)臟囊，內(nèi)臟囊含有各個(gè)臟器。肝包括消化腺和性腺，消化腺是橘黃色的大型腺體，與性腺共同占據(jù)了大部分內(nèi)臟囊。研究表明[3]：由于殼和內(nèi)臟囊之間有距離，已感染日本血吸蟲釘螺的這個(gè)微小距離，可被蟲體寄生導(dǎo)致消化腺腫大的擠壓而消失，同時(shí)，病理情況下釘螺肝臟腫大，呈淡棕色或灰白色，表面有許多大小不等、排列不齊的白斑，周圍為被擠壓的褐色肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。而釘螺肌纖維正常是呈長紡錘形的平滑肌纖維，核位于細(xì)胞中央[4]。

目前關(guān)于寄生蟲與宿主之間互作的病理組織切片的報(bào)道較少，釘螺相關(guān)的僅見有釘螺頭部神經(jīng)節(jié)病理切片[5]、日本血吸蟲毛蚴在釘螺體內(nèi)發(fā)育組織切片[6]。劉韜等[7]把感染斯氏艾美爾球蟲兔子的肝臟制作成組織切片，觀察到該蟲裂殖和配子生殖時(shí)期的蟲體；王時(shí)偉等[8]對(duì)感染柔嫩艾美爾球蟲的雞盲腸組織制作成病理切片，觀察發(fā)現(xiàn)盲腸腸絨毛上皮和腸腺及肌層均有蟲體寄生，并發(fā)生出血性病變；王時(shí)偉等[9]進(jìn)行了堆型艾美爾球蟲的分離與病理學(xué)探索，結(jié)果觀察到腸絨毛斷裂、脫落，在其上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)蟲體；呂元聰?shù)萚10]把感染弓形蟲的小白鼠臟器組織進(jìn)行了病理組織切片的制作與觀察，除腦組織未發(fā)現(xiàn)蟲體和病變，其他組織均有蟲體出現(xiàn)，對(duì)臨床癥狀不明顯或不足以確診的弓形蟲病，適合采集淋巴結(jié)制作成病理組織切片，以觀察是否有滋養(yǎng)體來確診該病。目前，日本血吸蟲毛蚴進(jìn)入釘螺后，在其體內(nèi)進(jìn)行發(fā)育過程而導(dǎo)致的病理變化尚未見報(bào)道。

因此，本試驗(yàn)通過對(duì)比分析感染日本血吸蟲的陽性釘螺、陰性釘螺的肌肉和肝臟組織的病理變化，從病理學(xué)角度揭示日本血吸蟲對(duì)釘螺造成的影響，以期為陽性釘螺的診斷鑒定提供病理學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 釘螺來源

江蘇省血吸蟲病防治研究所饋贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑

滅菌4%生理鹽水，4%多聚甲醛，石蠟，無水乙醇，雙蒸水，二甲苯，中性樹脂等。

1.2 方法

1.2.1 釘螺的鏡檢

將釘螺壓片，棄掉螺殼，通過鏡檢辨別鑒定陽性釘螺和陰性釘螺，步驟如下：

（1）用滅菌4%生理鹽水清洗釘螺3遍。

（2）把釘螺放在潔凈的載玻片上，用另一片載玻片壓碎釘螺，用鑷子棄掉螺殼，加一滴生理鹽水鏡檢。

（3）顯微鏡下觀察是否有日本血吸蟲胞蚴或尾蚴的存在，從而確定陽性和陰性釘螺。

（4）重復(fù)上述步驟，完成10只陽性釘螺和10只陰性釘螺的檢測，將沖洗干凈的軟體組織放入裝有4%多聚甲醛的凍存管中浸泡，用于制作組織切片。

1.2.2 組織切片的制作

將新鮮的釘螺軟體組織，按照以下步驟完成組織切片的制作[5]。

（1）固定：將鏡檢后的釘螺組織放在裝有4%多聚甲醛的凍存管中，浸泡72 h，備用。

（2）沖洗：將浸泡過4%多聚甲醛的釘螺組織用紗布包裹好，放入包埋盒中，置于大燒杯里，自來水沖洗2 h。

（3）智能脫水機(jī)程序：將自來水沖洗后的釘螺肉，連同包埋盒一同放入智能脫水機(jī)中脫水、透明和浸蠟。

（4）包埋：將包埋盒從智能脫水機(jī)中取出，拿出釘螺組織，放入石蠟?zāi)＞咧?，用生物組織自動(dòng)包埋機(jī)對(duì)釘螺組織塊進(jìn)行包埋，冷卻后切片。

（5）切片和展片：修整包埋好的釘螺組織蠟塊，并固定于切片機(jī)上，先粗切，后細(xì)切，切片厚度為8 μm，將切好的切片用毛筆蘸取下來，置于溫度為60℃恒溫水浴鍋中，展開，用多賴聚氨酸處理過的載玻片進(jìn)行撈片，使切片完整且完全展開。

（6）烘片：將樣本切片放入65℃烘箱中，進(jìn)行烘干，過夜。

（7）HE染色并顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 釘螺鏡檢結(jié)果

通過對(duì)釘螺進(jìn)行玻片重壓法解剖，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)其鏡檢，先用20倍鏡觀察是否有蟲體，發(fā)現(xiàn)有蟲體擺動(dòng)尾部后，用40倍鏡放大觀察蟲體，可確認(rèn)為日本血吸蟲尾蚴，如圖1所示：20×光學(xué)顯微鏡下可見數(shù)條尾蚴由體部和尾部構(gòu)成，體部呈長橢圓形，尾部具有細(xì)長尾干，尾干端部有分叉尾葉；圖2所示：40×光學(xué)顯微鏡下可見體部前端有口孔，腹中部表面有腹吸盤，體表有許多單根纖毛的乳頭狀感覺器官。

圖1 尾蚴（20×）Fig.1 Cercariae(20×)

圖2 尾蚴（40×）Fig.2 Cercariae(40×)

2.2 陽性和陰性釘螺組織切片對(duì)比

10只陽性釘螺和10只陰性釘螺共20個(gè)蠟塊樣本，每個(gè)樣本制作2張切片，每個(gè)樣本拍攝5張照片，共40張病理組織切片，200張病理組織切片照片。通過對(duì)這些組織切片的觀察，發(fā)現(xiàn)陽性釘螺與陰性釘螺的肌肉組織及肝臟的變化（表1）。陽性釘螺肌肉組織會(huì)出現(xiàn)色淡、腫脹，部分腫脹至斷裂，肌纖維排列混亂等現(xiàn)象（圖3、圖4）；陰性釘螺肌肉組織則較為飽滿、紅潤，且排列整齊（圖5、圖6）；陽性釘螺肝組織脆弱、易碎，出現(xiàn)充血和水泡樣變性，大量嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤，大量淋巴細(xì)胞和少量巨噬細(xì)胞的滲出，肝腺管壁含有豐富的多角形顆粒細(xì)胞，位于肝腺管邊緣（圖7、圖8）；陰性釘螺肝細(xì)胞胞質(zhì)飽滿，緊密，管壁上覆有纖毛上皮細(xì)胞，呈縱向褶皺（圖 9、圖 10）

表1 陽性釘螺和陰性釘螺組織切片對(duì)比Tab.1 Compared of positiveOncomelanias hupensis and negativeOncomelanias hupensistissue sections

圖3 陽性釘螺肌肉組織 (HE 200×)Fig.3 Positive Oncomelania muscle tissue(HE 200×)

圖4 陽性釘螺肌肉組織 (HE 400×)Fig.4 Positive Oncomelania muscle tissue(HE 400×)

圖5 陰性釘螺肌肉組織 (HE 200×)Fig.5 Negative Oncomelania muscle tissue(HE 200×)

圖6 陰性釘螺肌肉組織 (HE 400×)Fig.6 Negative Oncomelania muscle tissue(HE 400×)

圖7 陽性釘螺肝組織 (HE 200×)Fig.7 Positive Oncomelania hepatic tissue(HE 200×)

圖8 陽性釘螺肝組織 (HE 400×)Fig.8 Positive Oncomelania hepatic tissue(HE 400×)

圖9 陰性釘螺肝組織 (HE 200×)Fig.9 Negative Oncomelania hepatic tissue(HE 200×)

圖10 陰性釘螺肝組織 (HE 400×)Fig.10 Negative Oncomelania hepatic tissue(HE 400×)

3 討論

日本血吸蟲毛蚴入侵釘螺軟體后，經(jīng)過發(fā)育和無性繁殖，最后逸出尾蚴。這個(gè)過程包括毛蚴入侵、母胞蚴發(fā)育、子胞蚴發(fā)育、尾蚴成熟逸出等階段，且有明顯的移行過程。夏明儀等[11]應(yīng)用組織學(xué)方法觀察，發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲毛蚴除了入侵皮膚途徑外，至少57%的毛蚴是從釘螺本身的空口鉆入。舒利民[12]對(duì)釘螺感染日本血吸蟲毛蚴后，采用組織學(xué)檢測方法就毛蚴對(duì)釘螺的鉆穿及在釘螺體內(nèi)分布和移行進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)毛蚴鉆穿主要是在釘螺鰓部、頭足部的表皮和實(shí)質(zhì)組織。毛蚴入侵釘螺體內(nèi)并完成定位的過程，也是其完成從毛蚴轉(zhuǎn)變至母胞蚴的過程。母胞蚴在釘螺體內(nèi)經(jīng)過無性繁殖階段產(chǎn)生子胞蚴，并在釘螺體內(nèi)移行至消化腺，也就是最終的肝臟寄生部位。

本試驗(yàn)采用組織切片實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)陽性釘螺和陰性釘螺組織切片進(jìn)行制作與對(duì)比分析，初步獲悉了日本血吸蟲與釘螺互作過程中，釘螺肝臟組織與肌肉組織的病理變化。相對(duì)于陰性釘螺感染的螺肌肉，陽性釘螺肌肉出現(xiàn)色淡，腫脹可能是由于尾蚴發(fā)育需要吮吸釘螺血液，肌纖維腫脹斷裂，排列混亂是由于尾蚴在釘螺肌肉內(nèi)部進(jìn)行游走移行，破壞了肌纖維結(jié)構(gòu)，給釘螺帶來一定損害。同時(shí)，陽性釘螺肝臟細(xì)胞出現(xiàn)水泡樣變性，可能是由于釘螺肝臟是抗尾蚴入侵的重要部位，發(fā)生了強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。陽性釘螺肝臟出現(xiàn)的大量白細(xì)胞，如嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，大量淋巴細(xì)胞和少量巨噬細(xì)胞也提示釘螺肝臟處發(fā)生了炎癥反應(yīng)。陽性釘螺組織切片中觀察到嗜酸性粒細(xì)胞，引起嗜酸性粒細(xì)胞增多的感染性疾病主要為寄生蟲感染[13]，且日本血吸蟲對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞有明顯趨化作用[14]。而淋巴細(xì)胞增多后，具有對(duì)趨化性刺激做出直接反應(yīng)的能力，通過吞噬、胞飲和細(xì)胞毒性反應(yīng)等方式來排除異己，即釘螺通過內(nèi)部防御系統(tǒng)對(duì)入侵的血吸蟲幼蟲進(jìn)行攻擊。

通過本次試驗(yàn)，初步獲悉了陽性釘螺組織的病理變化，并且從病理學(xué)角度探索日本血吸蟲與釘螺互作的影響，為陽性釘螺的診斷鑒定提供病理學(xué)方面的參考。