董玉梅，洪玉，汪朦，桂飛，宋曉明，楊怡，諶容，黃瑾，楊磊，*

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832002；2杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310000）

理想的耳毒性動(dòng)物模型是研究聽(tīng)力損失及毛細(xì)胞再生的基礎(chǔ)，不同物種對(duì)同一耳毒性藥物的敏感性不同，甚至同一物種不同品系、不同年齡個(gè)體對(duì)同一耳毒性藥物的敏感性也有很大差異[1-3]，鑒于豚鼠對(duì)聲音敏感性過(guò)強(qiáng)，造模死亡率過(guò)高，大鼠耳蝸組織結(jié)構(gòu)不利于再生修復(fù)中的圓窗用藥，CBA近交系小鼠個(gè)體差異小[4-5]，適應(yīng)性較強(qiáng)，購(gòu)買和飼養(yǎng)費(fèi)用低廉，繁殖率較高，在內(nèi)耳的胚胎發(fā)育，解剖形態(tài)、生理穩(wěn)態(tài)等方面與人類相似性非常高，逐漸成為人類耳聾研究的理想模式動(dòng)物，快速建立CBA小鼠急性耳毒性模型具有巨大的潛在價(jià)值。

KM是氨基糖苷類廣譜抗生素，抗菌譜和新霉素相似[6]，它對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的損傷作用研究較少，尤其是對(duì)CBA品系小鼠耳蝸基底膜毛細(xì)胞損傷方面的研究更少。Fur是一種利尿劑，可以治療水腫性疾病也可以預(yù)防急性腎功能衰竭；然而呋塞米可引起體內(nèi)水、電解質(zhì)的紊亂，大劑量靜脈快速注射時(shí)可引起短暫的耳鳴及聽(tīng)力障礙；有研究報(bào)道KM+Fur聯(lián)合用藥可導(dǎo)致耳毒性與腎毒性。因此，本研究擬通過(guò)硫酸卡那霉素聯(lián)合呋塞米（KM+Fur）建立快速致聾CBA小鼠模型，通過(guò)檢測(cè)ABR聽(tīng)力閾值的改變并結(jié)合耳蝸基底膜鋪片HE染色綜合觀察，分析模型建立效果以及耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，為CBA小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷后再生修復(fù)，以及藥物性耳聾相關(guān)性研究的治療提供模型基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)選取5-8周60只雌雄各半的健康CBA小鼠（杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。小鼠耳廓反應(yīng)靈敏，外耳道通暢，實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)ABR聽(tīng)力閾值均正常。剪腳趾標(biāo)記，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、KM+Fur后 1 d組、KM+Fur后 3 d組、KM+Fur后 7 d組、KM+Fur后 14 d組、KM+Fur后 28 d組，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

硫酸卡那霉素（Kanamycin sulfate，KM），呋塞米（速尿 furosemide，F(xiàn)ur）Sigma公司；水合氯醛；4%多聚甲醛；磷酸鹽緩沖液（PBS）；蘇木素；伊紅；無(wú)水乙醇；二甲苯；中性樹(shù)脂（衢州巨化試劑有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

聽(tīng)性腦干反應(yīng)測(cè)試儀（美國(guó)TDT公司auditory brainstem response，ABR），解剖顯微鏡(Zeiss)，熒光倒置顯微鏡（Nikon），游絲鑷。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟及方法

1.4.1 藥物耳聾模型的建立

本研究對(duì)CBA小鼠進(jìn)行ABR閾值檢測(cè)后，采取一次性皮下注射硫酸卡那霉素，半小時(shí)后腹腔注射呋塞米。硫酸卡那霉素注射劑量為1 mg/g，呋塞米注射劑量為0.5 mg/g，進(jìn)行建立藥物耳聾模型，空白對(duì)照組不做任何處理。

1.4.2 ABR測(cè)試

各組在給藥前進(jìn)行ABR閾值檢測(cè)，用于排除先天聾或其他原因耳聾的動(dòng)物（聽(tīng)力閾值>45 dB則認(rèn)為該動(dòng)物聽(tīng)力異常），在給藥后各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行ABR閾值檢測(cè)，測(cè)試在隔音屏蔽室內(nèi)用美國(guó)TDT公司聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位儀完成。方法：動(dòng)物用5%水合氯醛溶液腹腔注射（0.1 mL/10 g）麻醉后置于恒溫加熱墊上，記錄電極置于兩耳中間（顱頂處），參考電極和接地電極分別放置在給聲側(cè)耳及對(duì)側(cè)耳部乳突處皮下，外置耳機(jī)放于小鼠耳水平處，距離10 cm，正對(duì)外耳道；刺激聲為短音（click burst），刺激頻率20次/秒，掃描時(shí)間為10 ms，濾波范圍100～3000 Hz，疊加 1024次，從 90 dB SPL開(kāi)始，每 5 dB SPL遞減，直到Ⅱ波消失記錄為該動(dòng)物的聽(tīng)力閾值，分別檢測(cè)每只動(dòng)物左右耳聽(tīng)力閾值。

1.4.3 HE染色

給藥后分別在不同時(shí)間進(jìn)行ABR檢測(cè)小鼠聽(tīng)力閾值，檢測(cè)完成后，將小鼠用5%的水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，麻醉后脫頸處死，取出雙側(cè)耳蝸，用4%的多聚甲醛溶液進(jìn)行固定24 h，將固定好的耳蝸剖去蝸殼，取出基底膜。取好的基底膜放在載玻片上，加蘇木素染色10 min。用水沖洗5～10 s，用1%的鹽酸乙醇沖洗5 s。放入水或PBS中10 min返藍(lán)。將水吸去，加伊紅染色 1 min。分別用 70、75、80、85、90、95、100%（無(wú)水乙醇）的乙醇沖洗 2～5 s。二甲苯透明2～5 s，風(fēng)干后用中性樹(shù)膠將樣本封片固定。鏡下觀察結(jié)果。細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，胞漿為淡紅色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

首先采用F檢驗(yàn)行樣本方差齊性檢驗(yàn)，然后采用T檢驗(yàn)比較組間差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;ABR閾值檢測(cè)數(shù)據(jù)以ABR閾值的均數(shù)表示，組間差異顯著性采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物整體觀察

納入的實(shí)驗(yàn)小鼠為60只，隨機(jī)分為6組，進(jìn)行結(jié)果分析的動(dòng)物為60只，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)脫失值。所有小鼠在在用藥后行為表現(xiàn)及進(jìn)食情況均正常，毛色光澤度好，未見(jiàn)任何中毒癥狀和死亡，各組小鼠用藥后無(wú)強(qiáng)迫環(huán)繞運(yùn)動(dòng)、肢體外展、偏頭、站立不穩(wěn)等前庭功能異?，F(xiàn)象。各組之間體重?zé)o明顯差異。

2.2 建模前后ABR閾值變化

ABR檢測(cè)是反映聽(tīng)功能的一項(xiàng)客觀指標(biāo)。小鼠聽(tīng)覺(jué)閾值位移（PTS）的變化，可作為本實(shí)驗(yàn)耳聾動(dòng)物模型建立是否成功的評(píng)估依據(jù)。本研究建模前后采用自身對(duì)照，建模前先檢測(cè)每組動(dòng)物的左右耳聽(tīng)力閾值是否常，聽(tīng)力閾值大于45分貝的則認(rèn)為該動(dòng)物的聽(tīng)力存在問(wèn)題，建立模型時(shí)則將聽(tīng)力存在異常的動(dòng)物排除，建模時(shí)只對(duì)聽(tīng)力正常的動(dòng)物進(jìn)行給藥；分別在給藥后 1、3、7、14、28 d 進(jìn)行樣本的收集，收集樣本前需進(jìn)行ABR的檢測(cè)，ABR檢測(cè)結(jié)果表明給藥后與給藥前進(jìn)行對(duì)比，聽(tīng)力閾值明顯升高；建模前與建模后對(duì)比分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說(shuō)明模型建立成功。

由圖1可知，ABR檢測(cè)的波形圖在建模1 d后聽(tīng)力閾值明顯升高，且與建模前的閾值相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)損傷后各組之間的ABR閾值無(wú)明顯變化，從功能上說(shuō)明急性耳聾動(dòng)物模型建立成功。

2.3 建模前后ABRⅡ波振幅的變化

小鼠一般以ABR的Ⅱ波來(lái)作為聽(tīng)覺(jué)反應(yīng)閾值的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。Ⅱ波振幅會(huì)隨著聲強(qiáng)的變化而改變，李登科[7]研究結(jié)果表明聲音從低到強(qiáng)變化時(shí)，振幅逐漸加強(qiáng)。由圖2可知給藥后ABRⅡ波振幅顯著降低，與給藥前相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而給藥后各組之間進(jìn)行對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。

2.4 耳蝸基底膜HE染色鋪片觀察

從圖3可以看出空白對(duì)照組耳蝸毛細(xì)胞的排列整齊；建模后1 d耳蝸底回毛細(xì)胞排列開(kāi)始出現(xiàn)輕微的紊亂；建模3 d后耳蝸毛細(xì)胞排列紊亂增加；建模后7 d耳蝸毛細(xì)胞紊亂嚴(yán)重；建模后14 d耳蝸毛細(xì)胞已經(jīng)看不出原來(lái)的排列方式；建模后28 d小鼠耳蝸毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)缺失，排列變形。由此可見(jiàn)，隨著硫酸卡那霉素?fù)p傷時(shí)間的延長(zhǎng)，給藥后各組與空白對(duì)照組相比較外毛細(xì)胞排列越來(lái)越紊亂。

圖1 建模前后ABR檢測(cè)小鼠聽(tīng)力閾值的變化Fig.1 Changes of hearing thresholds in mice after ABR detection

圖2 ABRⅡ波振幅分析Fig.2 ABRⅡwave amplitude analysis

圖3 觀察給藥后耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)變化HE染色Fig.3 HE staining to observe the changes of cochlear hair cells after administration

3 討論

氨基糖苷類抗生素對(duì)耳蝸的毒性機(jī)制至今仍不完全清楚[7-8]，而伴利尿劑可以促進(jìn)KM進(jìn)入內(nèi)耳淋巴液。呋塞米或利尿酸等藥物與KM聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可導(dǎo)致腎功能衰竭，推測(cè)其可能與伴利尿劑增強(qiáng)KM耳毒性的效應(yīng)有關(guān)[7-8]，從而導(dǎo)致耳蝸的功能發(fā)生不可逆的改變[9]?？敲顾睾瓦蝗茁?lián)合應(yīng)用，可嚴(yán)重?fù)p傷成年豚鼠耳蝸毛細(xì)胞，耳蝸底回毛細(xì)胞受損比頂回嚴(yán)重[10-11]。其中外毛細(xì)胞的損傷比內(nèi)毛細(xì)胞嚴(yán)重，而引起感音神經(jīng)性聾的主要原因之一是耳蝸外毛細(xì)胞受到損傷。本研究所選用的CBA小鼠為近交系小鼠，個(gè)體差異小，降低實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的誤差。研究表明CBA小鼠聽(tīng)力閾值和潛伏期更為穩(wěn)定[12]，有研究用CBA小鼠進(jìn)行慢性耳毒性的研究[13]，但未見(jiàn)報(bào)道用CBA小鼠建立急性耳毒性研究模型。

本研究使用的CBA小鼠建立的KM+Fur聯(lián)合用藥急性藥物損傷致聾模型，用自身對(duì)照的方法，減少了動(dòng)物個(gè)體差異所造成的實(shí)驗(yàn)誤差。KM和Fur聯(lián)合給藥1 d后小鼠的ABR閾值升高，給藥后1、3、7、14、28 d組ABR閾值均高于給藥前，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；由Ⅱ波的振幅分析得出結(jié)果，給藥后各組的振幅明顯降低且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；HE染色結(jié)果顯示，給藥后1 d，外毛細(xì)胞形態(tài)基本沒(méi)有改變，隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，外毛細(xì)胞的排列逐漸紊亂；由ABR閾值的檢測(cè)、振幅分析和HE染色的結(jié)果可以看出：本研究所建立的快速致聾CBA小鼠模型，考慮聽(tīng)力閾值發(fā)生改變可能是由于外毛細(xì)胞排列紊亂導(dǎo)致的。

綜上所述，KM+Fur一次性給藥，給藥后1 d觀察CBA小鼠ABR閾值，明顯高于給藥前，且給藥后28 d內(nèi)ABR閾值無(wú)明顯變化，提示該急性損傷致聾的方法導(dǎo)致聽(tīng)力損傷是不可逆的。該方法操作簡(jiǎn)單且損傷效果明顯，為藥物性耳聾實(shí)驗(yàn)研究提供了一種簡(jiǎn)單有效的建模方法。由于本實(shí)驗(yàn)采用的KM+Fur劑量單一、有局限性，有待于進(jìn)一步的優(yōu)化。