邢立行，李智偉，張中洲，王小義，姜慧嬌，陳雪玲，吳向未

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科,新疆 石河子 832008；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，新疆 石河子 832002）

缺血性疾病嚴(yán)重影響人類的健康，目前針對(duì)此類疾病的治療方式包括介入、溶栓、血管移植等，其中血管移植治療效果最佳，例如冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)。然而血管移植物的來(lái)源有限，使得探索良好血管替代物成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。血管組織工程是利用種子細(xì)胞、支架材料制備出血管的科學(xué)，用以解決血管移植治療中血管來(lái)源不足的問(wèn)題。目前，被用于血管組織工程的種子細(xì)胞中研究最多的是間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）和內(nèi)皮前體細(xì)胞（EPCs）[1]。Craig K 等[2-3]用MSCs作為種子細(xì)胞、Zhao Y等[4]用MSCs誘導(dǎo)分化得到的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞作為種子細(xì)胞構(gòu)建了組織工程化血管都得到理想效果。Quint C等[5-7]用EPCs也成功構(gòu)建了組織工程化血管。Hjortnaes J等[8]首次證明在體內(nèi)環(huán)境下EPCs、MSCs可聯(lián)合應(yīng)用于血管組織工程。本課題組研究發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中MSCs促進(jìn)EPCs增殖和血管形成[9]，EPCs聯(lián)合MSCs促進(jìn)血管修復(fù)[10]。Gnecchi M等[11]研究發(fā)現(xiàn)MSCs可通過(guò)分泌bFGF在內(nèi)的多種細(xì)胞因子促進(jìn)血管修復(fù)及再生，bFGF能促進(jìn)EPCs分化成內(nèi)皮樣細(xì)胞[12]。綜上所述，MSCs和EPCs都可以用作血管組織工程的種子細(xì)胞，這兩種細(xì)胞可互相促進(jìn)增殖、分化等過(guò)程，所以本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用未經(jīng)誘導(dǎo)分化成血管細(xì)胞的EPCs、MSCs體外構(gòu)建組織工程化血管，通過(guò)檢測(cè)CD34（血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記）、α-SMA（血管平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記）的蛋白水平探討聯(lián)合應(yīng)用兩種細(xì)胞是否比應(yīng)用單種細(xì)胞更有利構(gòu)建組織工程化血管及bFGF在構(gòu)建過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:C57BL/6小鼠，4-6周齡，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄不限，飼養(yǎng)在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，（動(dòng)物合格證號(hào)為 SCXK (新)2011-0003)，作為EPCs、MSCs的來(lái)源。實(shí)驗(yàn)試劑:低糖 DMEM、TRYPLE EXPRESS均購(gòu)自 Gibco公司，EGM-2 MV購(gòu)自Lonza公司，青鏈霉素、胎牛血清均購(gòu)自Hyclong公司，聚羥基乙酸無(wú)紡布支架（PGA 5 cm×10 cm）購(gòu)自上海Equl公司，0.1%Gelatin Solution明膠、鼠尾膠原、枸櫞酸鈉均購(gòu)自北京索萊寶生物公司，Murine FGF-basic購(gòu)自Peprotech公司，兔單克隆抗體[EP373Y]抗CD34、小鼠單克隆抗體 [1A4]抗alpha smooth muscle Actin購(gòu)自Abcam公司，DAB顯色劑、酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物，酶標(biāo)山羊抗小鼠IgG聚合物購(gòu)自中杉金橋公司。實(shí)驗(yàn)儀器:低速離心機(jī)（Bio-Rad公司），超凈工作臺(tái)（Thermo公司），熒光倒置顯微鏡、病理切片機(jī)（Leica公司），冰箱（海爾公司），蓋玻片、載玻片（中國(guó)江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材公司）。

1.2 細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定

小鼠骨髓來(lái)源MSCs、EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定按本實(shí)驗(yàn)室前期的方法[13-14]進(jìn)行。將2種細(xì)胞分別培養(yǎng)至3代備用。

1.3 PGA支架材料的處理

將PGA剪裁成0.5 cm×0.5 cm大小，用75%酒精、紫外線消毒處理后將其移至24孔板中，吸取30 μL鼠尾膠原均勻涂抹于PGA上備用。

1.4 細(xì)胞接種及細(xì)胞、PGA復(fù)合物的培養(yǎng)

接種細(xì)胞分組：EPCs組、MSCs組、EPCs聯(lián)合MSCs組、EPCs聯(lián)合 MSCs加 bFGF(100 ng/mL)培養(yǎng)組。

將3代的EPCs和MSCs用配制好的低糖DMEM(LG-DMEM，1%青鏈霉素，10%胎牛血清)分別制成1.5×106/mL的細(xì)胞懸液，其中bFGF組用含bFGF的低糖 DMEM（LG-DMEM，1%青鏈霉素，10%胎牛血清，100 ng/mLbFGF）制細(xì)胞懸液，并且這一組后期均用含bFGF的DMEM制作細(xì)胞懸液及培養(yǎng)。EPCs組取2 mL EPCs細(xì)胞懸液，MSCs組取2 mL MSCs細(xì)胞懸液，聯(lián)合組、bFGF組取EPCs和MSCs細(xì)胞懸液各1 mL共2 mL，將各組細(xì)胞懸液分別移至含PGA的孔板中。標(biāo)記后移至培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

12 h后將接種過(guò)細(xì)胞的細(xì)胞、PGA復(fù)合物移至新24孔板，按以上方法再次接種細(xì)胞，共反復(fù)接種4次后每24 h換液1次。

1.5 細(xì)胞與PGA支架材料的相容性分析

1.5.1 倒置顯微鏡觀察

細(xì)胞、PGA復(fù)合物培養(yǎng)1周時(shí)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否貼附在PGA上，以及細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.5.2 HE染色

細(xì)胞、PGA復(fù)合物培養(yǎng)1周時(shí)，取出復(fù)合物并用中性福爾馬林液固定；固定24 h后脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片（切片厚4 μm），將脫蠟水化的切片依次浸入蘇木素液（5 min）、酸化伊紅乙醇（1 min），脫水后封片。

1.6 組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色

1.6.1 HE染色

培養(yǎng)8周的細(xì)胞、PGA復(fù)合物HE染色步驟同前。

1.6.2 免疫組織化學(xué)染色

1.6.2.1 免疫組織化學(xué)染色方法

將培養(yǎng)8周后的各組細(xì)胞、PGA復(fù)合物包埋蠟塊，方法同前。切片后烤片2 h，二甲苯脫蠟5 min×3次；無(wú)水酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精梯度脫二甲苯，每次5 min。使用枸櫞酸鈉溶液修復(fù)抗原，高壓 8 min；蒸餾水浸洗 5 min×3次；3%過(guò)氧化氫常溫孵育10 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水浸洗5 min×3次；滴加適量CD34（1∶100）、α-SMA（1∶100）一抗，4℃孵育過(guò)夜；次日蒸餾水浸洗5 min×3次；滴加相應(yīng)二抗，37℃孵育30 min，蒸餾水浸洗5 min×3次；加DAB顯色1～5 min，顯微鏡下觀察著色情況及時(shí)用蒸餾水終止染色，蘇木素復(fù)染5 min，酒精梯度脫水，二甲苯透明，晾干，中性樹(shù)脂封片。

1.6.2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：<5%為 0分；6%～25%為 1分 ；26%～50%為 2分 ；51%～75% 為 3分 ；76%～100%為4分。按染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分；淺棕黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。兩項(xiàng)結(jié)果相乘：0～1 分為(-)，2～4 分為(+)，5～8 分為(++)，9～12 分為(+++)；(-)為陰性，(+)為弱陽(yáng)性，(++～+++)為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，多樣本均數(shù)間比較，方差齊采用單因素方差分析，若方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞與PGA支架材料的相容性分析

細(xì)胞、PGA復(fù)合物培養(yǎng)1周時(shí)，使用倒置顯微鏡觀察到PGA支架纖維呈不規(guī)則、交錯(cuò)的纏繞樣，大量細(xì)胞貼附在PGA支架纖維上，細(xì)胞與支架纖維的結(jié)合呈串珠狀（圖1A）。HE染色觀察到大量未降解的紫色PGA支架纖維和少量呈紫黑色的細(xì)胞核，紅色箭頭所指為貼附于PGA纖維上的細(xì)胞；黑色箭頭所指為PGA纖維（圖1B）。以上證明MSCs、EPCs可貼附于支架纖維上并存活良好。但同一細(xì)胞、PGA復(fù)合物HE染色觀察的細(xì)胞量明顯少于倒置顯微鏡觀察到的細(xì)胞量，考慮由于培養(yǎng)時(shí)間短，細(xì)胞與PGA支架貼附尚不夠牢固，并且在HE染色的操作過(guò)程中使細(xì)胞大量脫落所致。

圖1 1周時(shí)細(xì)胞與PGA相容性觀察Fig.1 Observation of the compatibility between cell and PGA at 1 weeks

2.2 MSCs聯(lián)合EPCs在體外培養(yǎng)血管的可行性分析

細(xì)胞、PGA復(fù)合物培養(yǎng)8周時(shí)，HE觀察PGA支架纖維已接近降解，細(xì)胞數(shù)量明顯增多并填充了原有支架纖維的空間。MSCs組的細(xì)胞成空泡狀，細(xì)胞之間不緊密。其余組的細(xì)胞排列整齊、均勻、緊密，并可見(jiàn)細(xì)胞外基質(zhì)樣成分。組間未見(jiàn)明顯差異（圖2）。

圖2 8周時(shí)組織學(xué)(HE)觀察（×200）Fig.2 Histology observation at 8 weeks（×200）

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：各分組α-SMA染色均為陰性，證明各分組中的干細(xì)胞都未分化成平滑肌細(xì)胞。MSCs組CD34染色為陰性，表明MSC沒(méi)有或極少分化成內(nèi)皮細(xì)胞。其余各組的CD34染色均為陽(yáng)性（圖3）。聯(lián)合組的CD34染色（強(qiáng)陽(yáng)性）評(píng)分明顯高與EPCs組（弱陽(yáng)性）和MSCs組（陰性），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。EPCs組CD34染色評(píng)分明顯高于MSCs組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 4）。

圖3 8周時(shí)免疫組織化學(xué)（CD34）觀察×200Fig.3 Immunohistochemistry(CD34)observation at 8 weeks（×200）

2.3 bFGF在MSCs聯(lián)合EPCs體外培養(yǎng)血管過(guò)程中的作用

bFGF組與聯(lián)合組的HE染色觀察細(xì)胞增殖、PGA降解均無(wú)明顯差異，免疫組織化學(xué)α-SMA染色均無(wú)著色，bFGF組的CD34染色（強(qiáng)陽(yáng)性）評(píng)分高于聯(lián)合組（強(qiáng)陽(yáng)性），但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖 4）。

圖4 8周時(shí)不同培養(yǎng)組的細(xì)胞、PGA復(fù)合物免疫組織化學(xué)染色(CD34)評(píng)分Fig.4 Statistical analysis of immunohistochemical staining(CD34)at 8 weeks

3 討論

目前有許多血管組織工程的構(gòu)建方法，但都離不開(kāi)支架材料、種子細(xì)胞和細(xì)胞因子這三大基礎(chǔ)。支架材料能為種子細(xì)胞及細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)提供支撐，并且有利于代謝。PGA支架材料對(duì)多種細(xì)胞具有親和、支持及粘附作用，已成功應(yīng)用于血管組織工程[15-16]。MSCs能分化成多種成熟細(xì)胞例如平滑肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等[17-18]。EPCs能分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞。大量研究用這兩種干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成的血管細(xì)胞構(gòu)建組織工程化血管，使得過(guò)程復(fù)雜，并且降低了細(xì)胞的增殖能力。

為了保留種子細(xì)胞的增殖和分化能力，本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用EPCs聯(lián)合MSCs在體外培養(yǎng)條件下構(gòu)建組織工程化血管，結(jié)果證明EPCs聯(lián)合MSCs培養(yǎng)比單種細(xì)胞培養(yǎng)更有利于細(xì)胞存活，并且更利于分化成內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞，即EPCs聯(lián)合MSCs更利于形成血管內(nèi)皮細(xì)胞。

細(xì)胞、支架材料復(fù)合物的培養(yǎng)環(huán)境分為靜態(tài)環(huán)境和動(dòng)態(tài)環(huán)境，靜態(tài)環(huán)境即細(xì)胞與支架在靜止?fàn)顟B(tài)下、沒(méi)有任何外界刺激的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。動(dòng)態(tài)環(huán)境分體內(nèi)和體外，體外為模擬動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境也稱為生物反應(yīng)器[19]。生物反應(yīng)器即模擬體內(nèi)血管的搏動(dòng)和血流對(duì)血管管壁的沖刷、壓力刺激[20-21]，是目前較為理想培養(yǎng)方式。而本實(shí)驗(yàn)采用體外靜態(tài)培養(yǎng)的方法，未應(yīng)用力學(xué)因素刺激，可能為本實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞、PGA復(fù)合物培養(yǎng)后均無(wú)平滑肌細(xì)胞的重要因素。細(xì)胞因子在血管形成過(guò)程中的作用是最復(fù)雜的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近40種促血管生成因子，研究較多的有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、bFGF、血管生成素和血小板衍化生長(zhǎng)因子。bFGF具有多種生物學(xué)活性，能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，且能調(diào)節(jié)新生血管的形成。本實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)bFGF的應(yīng)用無(wú)法達(dá)到理想的促血管生成作用，后期可嘗試聯(lián)合應(yīng)用其他細(xì)胞因子進(jìn)一步研究出理想細(xì)胞因子組合，以促進(jìn)組織工程化血管的構(gòu)建。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證明了MSCs、EPCs直接在體外聯(lián)合培養(yǎng)構(gòu)建組織工程血管可行性，但培養(yǎng)的血管組織不完整，無(wú)平滑肌細(xì)胞。在后期研究中可應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的細(xì)胞、PGA復(fù)合物，并bFGF聯(lián)合其他細(xì)胞因子共同應(yīng)用。進(jìn)一步促使EPCs聯(lián)合MSCs在體外培養(yǎng)出既有血管內(nèi)皮細(xì)胞又有血管平滑肌細(xì)胞的完整血管壁，甚至培養(yǎng)出完整的并具有一定強(qiáng)度和生長(zhǎng)性的血管，應(yīng)用于血管移植治療，有望解決臨床治療過(guò)程中血管移植物來(lái)源不足的難題。