張中洲，邢立行，李智偉，王小義，姜慧嬌，郭峰，吳向未*，陳雪玲

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，新疆 石河子 832008；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，新疆 石河子 832002）

細(xì)粒棘球蚴病又稱囊性包蟲?。╟ystic echinococcosis，CE），是一種常見的人畜共患病。尤其是在亞洲地區(qū)的該疾病的發(fā)病率較高[1-2]。而人類CE是由寄生絳蟲細(xì)粒棘球蚴幼蟲引起的[3]，因此對(duì)囊性包蟲病的治療顯得尤為必要。而目前對(duì)包蟲病的治療主要有手術(shù)和PAIR（Puncture-aspiration-injection-reaspiration）的侵入性治療，以及藥物性的非侵入性治療，但目前兩種方法均存在相應(yīng)的副作用[4-5]，研發(fā)副作用少的新型低毒藥物來治療包蟲病成為目前的趨勢(shì)。由于囊性包蟲病與腫瘤的臨床表現(xiàn)相似，因此我們選擇了化療藥物來治療CE。此治療方案能夠成為防治包蟲病的新的研究方向和切入點(diǎn)。

雷帕霉素（TOR）信號(hào)通路的PI3K-AKT-TOR在生物體內(nèi)對(duì)機(jī)體核糖體合成和蛋白質(zhì)生成起到了重要作用。其中的TOR蛋白激酶復(fù)合物在真核生物體內(nèi)存在兩種不同的功能結(jié)構(gòu)：TORC1和TORC2[6]，它通過調(diào)節(jié)下游靶蛋白核糖體S6激酶-1（S6K1）和真核翻譯起始因子 eIF4E結(jié)合蛋白1（4EBP1）以及AKT激酶來影響細(xì)胞的增殖，生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)[7]。TORC1和TORC2之間既能協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞的活性，也能通過負(fù)反饋?zhàn)饔枚嗷ビ绊慬8]。因此，只有同時(shí)阻斷TORC1和TORC2才能有效地抑制TOR蛋白激酶活性，進(jìn)而影響細(xì)胞信號(hào)通路PI3K-AKT-TOR。而AZD2014作為是一種新型的ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，研究表明它可以有效抑制TORC1和TORC2[9]。它不僅能抑制TORC1下游靶蛋白的活性，也能有效阻斷TORC1和TORC2之間的負(fù)反饋通路。從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，或加速其死亡，或誘導(dǎo)其凋亡[10]。有望用于治療占位性病變等腫瘤性疾病，成為新型化療藥物。

在這項(xiàng)研究中，我們?cè)隗w外用不同濃度的AZD2014培養(yǎng)原頭蚴，觀察其對(duì)原頭蚴活性的影響。我們希望為AZD2014治療肝細(xì)胞棘球蚴病提供依據(jù)，為治療包蟲病提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)材料和抗體

AZD2014獲自 Selleck（USA）。二甲基亞砜（DMSO），磷酸鹽緩沖鹽水（PBS），10%胎牛血清（FCS）和 RPMI1640購(gòu)自 Gibco-BRL（USA）。Caspase-3檢測(cè)試劑盒購(gòu)自 Applygen（中國(guó)北京）。（p）-AKT1 S473（目錄號(hào) ab81283;1：5,000），磷酸化（p）-S6K1T389（目錄號(hào) ab2571;2μg/ml），磷酸化 （p）-4EBP1T37（AKT1（目錄號(hào) ab28422;1∶2,000），S6K1（目錄號(hào)ab9366;1∶500）和 4EBP1（目錄號(hào) ab2606;1∶1,000），它們是從Abcam（UK）購(gòu)買的。 GAPDH（目錄號(hào)MB001;1∶10,000）從 Bioworld Technology，Inc。（USA）獲得。第二抗體包括過氧化物酶綴合的AffiniPure山羊抗兔 IgG（H+L）（目錄號(hào) ZB-2301;1∶10,000;USA）和山羊抗小鼠IgG（H＆L）-HRP（目錄號(hào)BS1248;1∶10,000;Bioworld Technology，Inc.，USA）。

1.2 原頭蚴的體外培養(yǎng)及處理

在新疆自治區(qū)昌吉市屠宰場(chǎng)收集自然感染細(xì)粒棘球絳蟲的綿羊肝臟，帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行徹底清洗并消毒，并于無菌條件下提取原頭蚴。然后用PBS（pH7.2）洗滌取得的原頭蚴，置于含有10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，于無菌條件（37 ℃；5%CO2）下培養(yǎng)使其適應(yīng)體外生存環(huán)境。3 d后，取出已培養(yǎng)的原頭蚴并用PBS（pH7.2）洗滌三次以去除無活性或者活性低的原頭蚴。0.1%伊-紅染色后于光學(xué)顯微鏡（Carl Zeiss Jena）下來觀察上述原頭蚴的活性，存活率≥98%可用于下一步試驗(yàn)。將上述原頭蚴進(jìn)行分組，每組約3000個(gè)，置于5 mL培養(yǎng)基中于無菌條件（37℃；5%CO2）下培養(yǎng)；取其中 6組標(biāo)記為Blank，DMSO，25、50、100、200 μmol/L；向以上 6 組培養(yǎng)基內(nèi)分別加入5μL的培養(yǎng)基，5μL的DMSO溶劑，2.5 μL的50 mmol/L的AZD2014溶液（AZD2014溶解于 DMSO溶劑），5 μL的 50 mmol/L的 AZD2014溶 液 ，2.5 μL的 200 mmol/L的AZD2014溶液，5 μL的 200 mmol/L的 AZD2014溶液；將上述分組培養(yǎng)的原頭蚴置于無菌條件（37℃；5%CO2）下培養(yǎng)10 d。每3 d更換培養(yǎng)基1次，每組的添加劑同首次。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。

1.3 光學(xué)顯微鏡下觀察原頭節(jié)存活率和形態(tài)

上述1.2中培養(yǎng)的6組原頭蚴，每24 h從6組中分別取約100個(gè)原頭節(jié)，0.1%伊-紅染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察每組原頭蚴的存活率和形態(tài)變化。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次存活率測(cè)試持續(xù)10 d。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western-blot檢測(cè)TOR下游蛋白因子p-Akt1、p-4EBP1、p-S6K1 的表達(dá)量

Blank，DMSO，100 μmol/L 組的原頭蚴培養(yǎng) 4 d后，用 PBS（pH7.2）反復(fù)清洗 3次后，分別將上述 3組原頭蚴轉(zhuǎn)移到3個(gè)無菌無酶EP管中。加入含有PMSF（Thermo Fisher Scientific，Inc.） 和磷酸酶抑制劑 混 合 物 （Thermo Fisher Scientific，Inc.） 的 RIPA（Thermo Fisher Scientific，Inc.）緩沖液以提取上述3個(gè)蛋白質(zhì)樣品。通過BCA（Thermo Fisher）測(cè)量蛋白質(zhì)樣品的濃度之后，根據(jù)所測(cè)3組蛋白的最低濃度配平其他提取蛋白樣品。然后對(duì)上述配平的蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，通過檢測(cè)蛋白印跡的相對(duì)灰度值來檢測(cè) TOR下游蛋白因子 p-Akt1、p-4EBP1、p-S6K1的表達(dá)量。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 原頭蚴Caspase-3酶活性檢測(cè)

取上述1.2中Blank，DMSO，100μM組的原頭蚴培養(yǎng)4 d后，用 PBS（pH7.2）反復(fù)清洗 3次后，分別將上述3組原頭蚴轉(zhuǎn)移到3個(gè)無菌無酶EP管中。根據(jù)Caspase-3試劑盒的說明書，檢測(cè)3組原頭蚴Caspase-3酶活性。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SPSS20.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）用于統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）；符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，多組之間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組之間比較采用T檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，比較的差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AZD2014對(duì)體外原頭形態(tài)的影響

在光學(xué)顯微鏡下觀察原頭節(jié)。在對(duì)照組（Blank，DMSO組）中，原頭蚴體積較大，且個(gè)體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整，未被伊-紅染液著色（圖1A、圖1B）。在實(shí)驗(yàn)組（25、50、100、200 μmol/L 組）中，隨著 AZD2014濃度的增加以及培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，原頭蚴體積縮小越明顯，并且其蟲體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重，一些原頭蚴的頂部小鉤從蟲體內(nèi)脫落，吸盤逐漸變形，透明度逐漸減少；更易被伊-紅染液著色（圖1C-1F）。因此，原頭蚴形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化對(duì)AZD2014具有劑量和時(shí)間依賴性的。

圖1 AZD2014作用4 d后的原頭蚴(50X)Fig.1 The protoscoleces were cultivated by AZD2014 for 4 days(50X)

2.2 AZD2014在體外對(duì)原頭生存率有影響

取 Blank，DMSO，25、50、100 和 200 μmol/L 各組原頭蚴，伊紅染色后，每24 h觀察一次原頭蚴活性，在光學(xué)顯微鏡下連續(xù)觀察10 d并統(tǒng)計(jì)各組原頭蚴的存活率，并繪制存活率圖（圖2）。空白組和DMSO組的原頭蚴存活率沒有明顯變化。

在25 μmol/L和50 μmol/L組中原頭蚴存活率的變化不明顯。而100 μmol/L和 200 μmol/L組的原頭蚴活性卻發(fā)生了顯著變化，在AZD2014作用后的第4天其成活率分別為75.93%±7.28%，41.02%±34.62%；與對(duì)照組（Blank組，DMSO組）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖2 原頭蚴活力曲張圖Fig.2 The vitality chart of protoscoleces

2.3 AZD2014對(duì)體外培養(yǎng)原頭蚴的p-AKT1，p-4EBP1和p-S6K1表達(dá)的影響

100 μmol/L的AZD2014體外作用于原頭蚴4 d后。其中Blank和DMSO兩組中p-AKT1，p-4EBP1和p-S6K1的表達(dá)水平變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

而 100 μmol/L組中原頭蚴的 p-AKT1，p-4EBP1和 p-S6K1的表達(dá)量為：19.40±2.87，11.52±3.68，14.94±0.29；水平明顯低于 Blank和 DMSO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 3）。

圖3 原頭蚴蛋白因子p-AKT1，p-4EBP1和p-S6K1表達(dá)情況Fig.3 The expression of P-AKT1、P-4EBP1 and P-S6K1 in protoscoleces

2.4 AZD2014對(duì)體外培養(yǎng)原頭蚴的Caspase-3酶活性的影響

100 μmol/L的 AZD2014體外作用于原頭蚴 4 d后，其中Blank組和DMSO組的Caspase-3酶活性變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

而 100 μmol/L組 Caspase-3酶活性為:59.67±2.94；與對(duì)照組（Blank，DMSO 組）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 4）。

圖4 原頭蚴凋亡因子Caspase-3表達(dá)情況Fig.4 The expression of apoptesis factor caspase-3 in protoscoleces

3 討論

目前，化療藥物是人類CE的主要非侵入性治療藥物，如口服阿苯達(dá)唑和苯并咪唑等藥物[2,4]。除了H2O2，20%的高滲鹽水，95%的酒精等局部化療藥物外，也會(huì)引起不諸多良反應(yīng)。同時(shí)局部化療藥物對(duì)于治療人類CE也是特別不理想的。以治療CE為目標(biāo)，我們開發(fā)了一種新的促進(jìn)原頭節(jié)細(xì)胞凋亡的抗腫瘤化療藥物。

TOR是PI3K-TOR細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)激酶之一。當(dāng)TOR受到抑制，PI3K-TOR途徑被阻斷時(shí)，細(xì)胞的生物活性將受到顯著影響[11-13]。在我們的研究中，用于臨床試驗(yàn)的AZD2014[14-15]用于體外培養(yǎng)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)。研究了不同濃度AZD2014對(duì)原頭節(jié)的影響。在我們的研究中，AZD2014作用于原頭蚴4 d后，其存活率為79.82%±10.65%。在第1天和第7天，100 μmol/L組原球蛋白的存活率分別為97.03%±0.76%和66.65%±12.35%。在100 μmol/L組中，粒細(xì)胞質(zhì)原顆粒的生存力的變化是逐漸變化的。上述結(jié)果表明AZD2014可阻滯TOR酶活性的表達(dá)。

AKT1，S6K1和 4EBP1是 TORC1和 TORC2蛋白激酶的下游蛋白[16]。因此，當(dāng)TORC1和TORC2被阻斷時(shí)，AKT1，S6K1和4EBP1磷酸化水平的表達(dá)量會(huì)明顯降低[17-18]。而在本實(shí)驗(yàn)研究中，AZD2014作為雙TOR抑制劑作用于原頭蚴，通過Western-blot進(jìn)一步驗(yàn)證表明，在AZD2014作用于原頭蚴4 d后，其p-AKT1，p-S6K1和p-4EBP1的表達(dá)量均出現(xiàn)明顯下降，說明AZD2014在原頭蚴體內(nèi)阻滯了AKT1，S6K1和4EBP1 3個(gè)蛋白因子的磷酸化過程，進(jìn)而影響原頭蚴的活性。

真核細(xì)胞死亡通常涉及細(xì)胞凋亡和程序性細(xì)胞死亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的一個(gè)分子，具有相同的其他誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子的代謝途徑。研究表明Caspase-3及其家族的caspase介導(dǎo)物是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶[19]。隨著Caspase-3及其家族caspase介導(dǎo)的過度激活和表達(dá)，細(xì)胞死亡水平增加[20-21]。一些科學(xué)家聲稱，Caspase-3參與原頭節(jié)細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)高水平。具體而言，活性中的胱天蛋白酶-3的活性高于粒狀原粒體的無活性囊腫。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，100 μmol/L組的原頭蚴在培養(yǎng)4 d后，其Caspase-3酶活性表達(dá)量明顯升高，因此AZD2014可加快原頭蚴的死亡。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AZD2014對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭蚴有顯著的抑制殺滅作用。將AZD2014通過靶向途徑來治療包蟲病，有望為人類包蟲病的治療提供新的方案。本實(shí)驗(yàn)研究為治療包蟲新藥的研究提供了新的方向。為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，我們將在動(dòng)物模型體內(nèi)進(jìn)行該類藥物的體內(nèi)試驗(yàn)，探索AZD2014對(duì)人體的有效性和安全性，為臨床醫(yī)學(xué)提供理論基礎(chǔ)。