許 楊 王佳佳 葛倩倩 崔彥婷 馬 驪 李 健,2

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脊尾白蝦基因克隆及、和在不同蛻皮分期的表達(dá)分析*

許 楊1王佳佳1葛倩倩1崔彥婷1馬 驪1李 健1,2①

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071； 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

本研究在克隆脊尾白蝦()基因(, GenBank No. KY471317)的基礎(chǔ)上，探討了其在蛻皮過(guò)程中的作用，同時(shí)也探討了克隆脊尾白蝦的蛻皮激素受體基因()和維甲酸X受體基因()在不同蛻皮分期的表達(dá)特征。克隆的基因全長(zhǎng)為3944 bp，包括2520 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)。該開(kāi)放閱讀框編碼一個(gè)由839個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為92.307 kDa，理論等電點(diǎn)為7.48。EcE75蛋白包含1個(gè)C4鋅指結(jié)構(gòu)，1個(gè)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且有1個(gè)明顯的跨膜螺旋?；蛟谶M(jìn)化上具有一定的保守性，與甲殼動(dòng)物聚為一支，與三疣梭子蟹()、黑背地蟹()、凡納濱對(duì)蝦()、中國(guó)明對(duì)蝦()等親緣關(guān)系最近?；蛟诩刮舶孜r的各組織中均有表達(dá)，其中，眼柄中的表達(dá)量最高，卵巢次之。在不同蛻皮分期中，與、的表達(dá)規(guī)律基本一致，生殖蛻皮前期和后期表達(dá)量都比生長(zhǎng)蛻皮高。生長(zhǎng)蛻皮和生殖蛻皮因?yàn)槁殉舶l(fā)育而存在明顯不同，蛻皮激素對(duì)卵巢發(fā)育的刺激作用，通過(guò)、和基因的表達(dá)上調(diào)可以體現(xiàn)出來(lái)。對(duì)、和基因在不同蛻皮分期的表達(dá)研究，為了解蝦蟹類蛻皮機(jī)制提供了參考信息。

脊尾白蝦；；；；蛻皮期

蛻皮貫穿甲殼動(dòng)物的整個(gè)生活史，與其生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖息息相關(guān)。蛻皮主要受互為拮抗的Y-器官分泌蛻皮激素(MH, 蛻皮甾類)和眼柄內(nèi)X-器官竇腺?gòu)?fù)合體分泌蛻皮抑制激素(MIH)影響。蛻皮激素是調(diào)控甲殼動(dòng)物蛻皮及變態(tài)發(fā)育的重要激素，它的活性形式是20-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)。在昆蟲(chóng)體內(nèi)，蛻皮激素受體(Ecdysteroid receptor, ECR)與超氣門蛋白(Ultraspiracle, USP)形成異源二聚體，在甲殼動(dòng)物體內(nèi)，ECR與維甲酸X受體(Retinoid X receptor, RXR)形成異源二聚體(Yao, 1994; Verhaegen, 2011)。這些二聚體與20E結(jié)合后形成的受體復(fù)合物直接激活E75等蛻皮激素早期應(yīng)答因子，形成初級(jí)應(yīng)答反應(yīng)(Riddiford, 2003; Thummel, 2002)。早期應(yīng)答因子誘導(dǎo)表達(dá)的蛻皮激素次級(jí)應(yīng)答基因級(jí)聯(lián)放大蛻皮激素信號(hào)，對(duì)蛻皮、變態(tài)、生殖等生理過(guò)程起調(diào)控作用(Dubrovsky, 2005)。在昆蟲(chóng)中，基因首先在果蠅(Drosophilidae)中分離得到，Crossgrove等(2008)研究表明，對(duì)果蠅的蛻皮、變態(tài)及成蟲(chóng)雌蠅的卵室發(fā)育有重要作用。果蠅存在和三種亞型，突變使幼體發(fā)育過(guò)程中蛻皮激素水平降低，導(dǎo)致發(fā)育遲緩、蛻皮缺陷等現(xiàn)象(Bialecki, 2002)。突變對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖無(wú)明顯影響，突變導(dǎo)致果蠅在成蟲(chóng)期死亡。在甲殼動(dòng)物中，首先在刀額新對(duì)蝦()中分離鑒定，而后又在中國(guó)明對(duì)蝦()、三疣梭子蟹()、凡納濱對(duì)蝦()、黑背陸地蟹()和大型蚤()等物種中被分離鑒定(Chan, 1998; Priya, 2010; Qian, 2014; Kim, 2005; Hannas, 2010; Litoff, 2014)。對(duì)在甲殼動(dòng)物蛻皮激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用研究較少。

學(xué)者們對(duì)脊尾白蝦()的蛻皮相關(guān)基因進(jìn)行了研究，梁俊平等(2015)克隆了基因，并分析其在卵巢和胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況。柳飛等(2016)克隆了基因，并分析其在溫度、鹽度脅迫和蛻皮周期中的表達(dá)情況。張美等(2016)克隆了基因，并分析其在pH和氨氮脅迫中的表達(dá)規(guī)律。而關(guān)于脊尾白蝦的基因的研究至今尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究結(jié)合脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆基因cDNA全長(zhǎng)，通過(guò)熒光定量PCR分析了該基因在脊尾白蝦的組織表達(dá)分布及在不同蛻皮分期和的表達(dá)規(guī)律，以比較生長(zhǎng)蛻皮和生殖蛻皮的不同，為了解蝦蟹類蛻皮機(jī)制提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

脊尾白蝦取自山東省日照海辰水產(chǎn)有限公司，均為活力好、大小均勻的健康個(gè)體，體長(zhǎng)為(5.42± 0.34) cm，體重為(1.58±0.22) g。將實(shí)驗(yàn)用蝦暫養(yǎng)于200 L的PVC桶中，每桶50尾，暫養(yǎng)海水鹽度為31，pH為8.2，水溫為24℃，24 h持續(xù)通氣充氧。每天早晚2次飼喂蛤蜊肉，吸污換水1/3，連續(xù)養(yǎng)殖7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 2種蛻皮的區(qū)分及樣品處理 未性成熟的脊尾白蝦處于生長(zhǎng)期，該組實(shí)驗(yàn)蝦的蛻皮為生長(zhǎng)蛻皮。性成熟的實(shí)驗(yàn)蝦分為卵巢發(fā)育蝦和抱卵蝦，其中，卵巢發(fā)育且?guī)в懈顾{(lán)者的蛻皮為生殖蛻皮。根據(jù)中華鋸齒米蝦()(王戰(zhàn)芳, 2014)和凡納濱對(duì)蝦(Gao, 2015)的方法進(jìn)行蛻皮分期，分為蛻皮間期(C期)、蛻皮后期(軟皮期，AB期)、蛻皮前期(D期，取自特征明顯的D2亞期)。實(shí)驗(yàn)用蝦暫養(yǎng)1周后，挑選活力好、無(wú)殘缺的個(gè)體，用解剖剪剪取尾節(jié)末端，置于倒置顯微鏡，觀察分期并拍照。將確定分期的脊尾白蝦每尾蝦取0.1 ml血與0.1 ml預(yù)冷的抗凝劑混合，于4℃下5000 r/min離心10 min，棄上清液后加入1 ml Trizol，然后，再采集肝胰腺、鰓、肌肉、腸、胃、眼柄、大顎器、表皮、外殼、腹神經(jīng)節(jié)、卵巢和心共12種組織。液氮研磨后，稱取50 mg樣品，置于無(wú)RNA酶離心管中，并加入1 ml Trizol，震蕩混勻后，置于–80℃冰箱保存。每個(gè)平行取3尾，每個(gè)蛻皮分期共3個(gè)平行。

1.2.2 總RNA提取和cDNA合成 采用Trizol試劑法提取各組織的總RNA，核酸定量?jī)x(NanoDrop 2000, Thermo)測(cè)定純度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)濃度及完整性。利用SMARTTMRACE Amplifica- tion Kit (Clontech)合成cDNA模板。

1.2.3基因cDNA全長(zhǎng)的克隆 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和NCBI上Blast的比對(duì)結(jié)果，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和(表1)，以1.2.2中合成的cDNA為模板，使用HiFi酶進(jìn)行基因中間片段的擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：cDNA模板1 μl，HiFi Buffer 2 μl，dNTP (2.5 mmol/L) 1.6 μl，引物(上、下游)各1 μl，HiFi酶(5 U/ml) 0.2 μl，滅菌水補(bǔ)至20 μl。

PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min；94℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的TAE瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)后，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit (TaKaRa)切膠回收，并純化檢測(cè)。切膠回收產(chǎn)物與pEASY-T1載體連接后，將5 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到50 μl Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。在含AMP、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單一白斑菌落繼續(xù)培養(yǎng)6 h。菌落PCR鑒定后，將含有目的條帶的菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)，此序列片段與其他物種的基因同源性較高，確定為脊尾白蝦的基因序列片段。

根據(jù)上述擴(kuò)增得到的中間片段利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3￠和5￠RACE引物E75 3￠RACE和E75 5￠RACE(表1)，用于RACE擴(kuò)增基因cDNA全長(zhǎng)序列。使用Smart Race試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行3′RACE和5￠RACE PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為3￠/5￠RACE cDNA 0.5 μl，10×Advantage 2 PCR Buffer 2.0 μl，dNTP(10 mmol/L) 0.2 μl，3￠/5￠引物格0.2 μl，50× Advantage 2 Polymerase 0.2 μl，UPM(10×) 1 μl，PCR級(jí)H2O 6.9 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3 min；95℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降0.5℃；95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 3 min，20個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、克隆、測(cè)序與基因中間片段的克隆方法相同。

1.3 EcE75基因的生物信息學(xué)分析

使用DNAStar軟件中的SeqMan程序?qū)y(cè)序所得的中間片段和3￠、5￠末端序列進(jìn)行拼接，得到基因全長(zhǎng)。利用ExPASy(http://www.expasy.ch/tools/)和Gene Tool軟件預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框(ORF)和蛋白質(zhì)序列。使用Predict Protein和SMART服務(wù)器進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)和功能結(jié)構(gòu)域分析。使用TMpred進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。使用ClustalX和DNAman軟件對(duì)脊尾白蝦和其他物種的E75氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，并用MEGA 6.07軟件以鄰接法(Neighbour- Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，1000次Bootstrap重復(fù)檢驗(yàn)進(jìn)化樹(shù)的置信度。

1.4 EcE75基因組織表達(dá)分析

根據(jù)已獲得的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物E75RT-F和E75RT-R，并以脊尾白蝦18S rRNA為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)引物18sF與18sR (表1)。利用Real-time PCR檢測(cè)脊尾白蝦不同組織基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系和程序參考FS Universal SYBR Green Master(ROX)說(shuō)明書(shū)，采用10 μl反應(yīng)體系。反應(yīng)程序：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s；60℃ 1 min； 95℃ 15 s。實(shí)驗(yàn)中每3尾混合作為1個(gè)樣品，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)為3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用2?DDCt法計(jì)算脊尾白蝦基因在各組織中的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 EcRXR、EcECR和EcE75基因在不同蛻皮分期的組織表達(dá)分析

根據(jù)GenBank的基因序列(GenBank No. KU647675)，(GenBank No. KC506600)，(GenBank No. KY471317)，利用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)特異引物RXRRT-F、RXRRT-R；EcRRT-F、EcRRT-R；E75RT-F、E75RT-R，并以脊尾白蝦18S rRNA為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)引物18sF與18sR，對(duì)生長(zhǎng)蛻皮和生殖蛻皮不同分期眼柄中基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

表1 研究所用的引物序列

Tab.1 Primers used in this study

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，<0.05認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EcE75基因cDNA全長(zhǎng)克隆及序列分析

通過(guò)RACE技術(shù)成功獲得基因cDNA序列全長(zhǎng)。該基因全長(zhǎng)為3944 bp，包括2520 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，450 bp的5￠非編碼區(qū)(5′UTR)和 974 bp的3￠非編碼區(qū)(3￠UTR)。經(jīng)PredictProtein軟件預(yù)測(cè)，基因編碼一個(gè)由839個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為92.307 kDa，理論等電點(diǎn)為7.48，脂溶系數(shù)為77.07，親水指數(shù)(GRAVY)為–0.417。經(jīng)SMART服務(wù)器預(yù)測(cè)，EcE75蛋白包含1個(gè)C4鋅指結(jié)構(gòu)(位于第32~104個(gè)氨基酸之間)、1個(gè)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(位于第207~366個(gè)氨基酸之間)及6個(gè)低組分復(fù)雜區(qū)域(分別位于第396~408個(gè)氨基酸、第419~443個(gè)氨基酸之間、第499~514個(gè)氨基酸之間、第574~627個(gè)氨基酸之間、第685~691個(gè)氨基酸之間以及第716~736個(gè)氨基酸之間)，具體位置見(jiàn)圖1。經(jīng)TMpred軟件預(yù)測(cè)，基因有1個(gè)明顯的跨膜螺旋，跨膜方向?yàn)橛蓛?nèi)向外，由第297~313個(gè)氨基酸構(gòu)成，得分為580，預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

虛線下劃線表示C4鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域，方框表示配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，小方框(ATG)表示起始密碼子，小方框*表示終止密碼子，其他下劃線表示6個(gè)低組分復(fù)雜區(qū)域

The dotted line represents the C4 zinc finger structure, the box represents the ligand binding domain, the small box (ATG) represents the start codon, the small box * indicates the stop codon, and the underlines represent the 6 low component complex regions

圖2 EcE75跨膜螺旋預(yù)測(cè)

2.2 EcE75蛋白同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

經(jīng)過(guò)多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，EcE75蛋白與三疣梭子蟹、凡納濱對(duì)蝦、中國(guó)明對(duì)蝦、黑背陸地蟹、刀額新對(duì)蝦同源性較高，可以證明此序列就是脊尾白蝦的E75蛋白(圖3)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，EcE75蛋白在進(jìn)化上具有一定的保守性，與甲殼動(dòng)物聚為一支，與三疣梭子蟹、黑背陸地蟹、凡納濱對(duì)蝦、中國(guó)明對(duì)蝦等親緣關(guān)系最近，相似性分別為79%、79%、78%和78%(圖4)。

2.3 EcE75基因組織表達(dá)分析

采用RT-PCR方法檢測(cè)脊尾白蝦肝胰腺、鰓、肌肉、腸、血、胃、心、表皮、殼、卵巢、眼柄、大顎器和腹神經(jīng)節(jié)共13種組織中基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，基因在13種組織中均有表達(dá)，眼柄表達(dá)量最高，卵巢次之，肌肉和血細(xì)胞表達(dá)量較低，肝胰腺中最低(圖5)。

KY471317;ACF36863.1;AAY89587.2;AGS94407.1;O77245.1;AJT60335.1

2.4 EcRXR基因在不同蛻皮分期的表達(dá)分析

基因在不同蛻皮分期的脊尾白蝦眼柄中的表達(dá)情況如圖6所示。生長(zhǎng)蛻皮時(shí)，的表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢(shì)，蛻皮間期顯著高于蛻皮前期和后期(0.05)，蛻皮前期和后期差異不顯著；生殖蛻皮時(shí)，的表達(dá)量呈逐漸升高的趨勢(shì)，蛻皮間期顯著低于蛻皮前期和后期(0.05)，蛻皮前期和后期差異不顯著；蛻皮間期時(shí)，生長(zhǎng)蛻皮顯著高于生殖蛻皮(0.05)；蛻皮前期和后期時(shí)，生長(zhǎng)蛻皮顯著低于生殖蛻皮(0.05)。

2.5 EcECR基因在不同蛻皮分期的表達(dá)分析

基因在不同蛻皮分期的脊尾白蝦眼柄中的表達(dá)情況如圖7所示，生長(zhǎng)蛻皮時(shí)，的表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢(shì)，蛻皮間期顯著高于蛻皮前期(0.05)，蛻皮前期顯著高于蛻皮后期(0.05)；生殖蛻皮時(shí)，蛻皮前期顯著高于蛻皮間期和后期(0.05)，蛻皮間期與后期差異不顯著；間期時(shí)，生長(zhǎng)蛻皮顯著高于生殖蛻皮(0.05)；前期和后期時(shí)，生長(zhǎng)蛻皮顯著低于生殖蛻皮(0.05)。

圖4 脊尾白蝦與其他物種的E75蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

標(biāo)尺長(zhǎng)度表明每個(gè)位點(diǎn)發(fā)生0.05次置換

The length of the ruler indicates 0.05 replacements at each site

圖5 EcE75基因在不同組織中的表達(dá)

不同字母代表組織間差異顯著(0.05)

Different letters mean significant difference among tissues at 0.05 level

圖6 EcRXR基因在不同蛻皮分期的表達(dá)

同種蛻皮的不同分期用大寫(xiě)字母表示差異顯著(0.05)，不同種蛻皮的同一分期用小寫(xiě)字母表示差異顯著(0.05)。下同

Capital letters indicate significant difference among different stages of the same type of molting, while lower case letters indicate significant difference between different types of molting in the same stages. The same as below

圖7 EcECR基因在不同蛻皮分期的表達(dá)

2.6 EcE75基因在不同蛻皮分期的表達(dá)分析

基因在不同蛻皮分期的脊尾白蝦眼柄中的表達(dá)情況如圖8所示。的表達(dá)量在生長(zhǎng)蛻皮時(shí)，蛻皮后期顯著低于蛻皮間期和前期(0.05)，蛻皮間期和前期差異不顯著；生殖蛻皮時(shí)，蛻皮前期顯著高于蛻皮間期和后期(0.05)，蛻皮間期與后期差異不顯著；蛻皮間期和后期時(shí)，生長(zhǎng)蛻皮顯著高于生殖蛻皮(0.05)，前期時(shí)，生長(zhǎng)蛻皮顯著低于生殖蛻皮(0.05)。

圖8 EcE75基因在不同蛻皮分期的表達(dá)

3 討論

本研究首次克隆得到脊尾白蝦的基因，該基因全長(zhǎng)為3944 bp，包括2520 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，該開(kāi)放閱讀框編碼839個(gè)氨基酸。基因編碼的蛋白包含1個(gè)C4鋅指結(jié)構(gòu)、1個(gè)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域及 6個(gè)低組分復(fù)雜區(qū)域。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，克隆得到的基因具有E75基因典型的結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，脊尾白蝦E75在進(jìn)化上具有一定的保守性，與甲殼動(dòng)物聚為一支，與三疣梭子蟹、黑背地蟹、凡納濱對(duì)蝦、中國(guó)明對(duì)蝦等親緣關(guān)系最近，表明本研究克隆得到的基因確定為脊尾白蝦基因?；蛟诩刮舶孜r的13種組織中均有表達(dá)，其中，眼柄的表達(dá)量最高，卵巢次之。不同物種的組織表達(dá)量有差異，如凡納濱對(duì)蝦肌肉中表達(dá)量最高，眼柄次之(錢昭英, 2014)；三疣梭子蟹眼柄中表達(dá)量最高，表皮次之(Xi, 2016)。而脊尾白蝦基因在眼柄和卵巢中的高表達(dá)，暗示其可能與蛻皮及卵巢發(fā)育相關(guān)，需要進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證。

眼柄對(duì)于甲殼動(dòng)物蛻皮調(diào)控具有重要作用，且和基因在眼柄中都具有高的表達(dá)量，因此，本研究檢測(cè)了不同蛻皮分期和的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示，與的表達(dá)規(guī)律基本一致，生殖蛻皮的蛻皮前期和后期表達(dá)量都比生長(zhǎng)蛻皮高。Lachaise等(1981)和Chan(1995)研究表明，在卵巢的發(fā)育過(guò)程中，隨著卵巢的逐漸成熟，蛻皮激素的濃度隨之增加，在產(chǎn)卵前下降，而蛻皮激素的活性形式20E需要結(jié)合ECR和RXR形成的二聚體，從而導(dǎo)致和表達(dá)量升高。在生殖蛻皮的蛻皮后期表達(dá)量高于蛻皮前期，這與Durica等(1996)的研究結(jié)果相似，推測(cè)可能與卵巢發(fā)育有關(guān)?；蛟谏惩懫さ谋磉_(dá)規(guī)律與一致，而生長(zhǎng)蛻皮前期，表達(dá)量與蛻皮間期表達(dá)量差異不顯著，與和的表達(dá)規(guī)律不一致，原因有待進(jìn)一步研究。生長(zhǎng)蛻皮與生殖蛻皮的主要區(qū)別在于生殖蛻皮伴隨卵巢發(fā)育，而本研究中，相較于生長(zhǎng)蛻皮，、和在生殖蛻皮的高表達(dá)，說(shuō)明其可能與脊尾白蝦的卵巢發(fā)育有關(guān)。通過(guò)對(duì)脊尾白蝦、和基因在不同蛻皮分期的表達(dá)研究，為蝦蟹類蛻皮機(jī)制及苗種育成提供了參考信息。

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(編輯 馬璀艷)

Cloning ofGene and Expression Analysis of,andDuring Different Molting Stages of

XU Yang1, WANG Jiajia1, GE Qianqian1, CUI Yanting1, MA Li1, LI Jian1,2①

(1. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071)

Based on the cloning of(, GenBank accession number: KY471317), we studied its role in molting and the expression pattern ofandduring different stages of molting. The full-length cDNA ofis 3944 bp long, which contains an open reading frame (ORF) of 2520 bp. The protein encoded byis composed of 839 amino acids. The estimated mass of the deduced amino acid sequence ofis 92.307 kDa, and the calculated theoretical isoelectric point (pI) is 7.48. The ZnF_C4 and the HOLI domains were detected in, and one distinct transmembrane helix was identified. The geneis conserved during evolution. The phylogenetic tree constructed based on E75 sequences showed that EcE75 was clustered with that of the same clade of crustaceans.has the highest homology with,,,andThe tissue distribution analysis showed thattranscript could be detected in all tested tissuesof,and relatively abundant in eyestalk and ovary. The expression pattern of the genes,, andwas consistent during different stages of molting. At the premoult and postmoult stages, the expression of genes of reproductive molting was significantly higher than that of growth molting. The results showed that there was significant difference between the growth and reproductive molting because of the ovary development. Furthermore, it revealed the effect of ecdysone stimulation on ovarian development through the upregulation of expression of the genes,, and. The present study on the expression of the genes,, andat different stages of molting provides a theoretical basis and a scientific ground for further research on the mechanism of molting.

;;;; Molting stage

LI Jian, E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

S917.4

A

2095-9869(2018)04-0110-09

10.19663/j.issn2095-9869.20170328001

* 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(CARS-48)、泰山產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才工程項(xiàng)目(LJNY2015002)和青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2015ASKJ02)共同資助[This work was supported by China Agriculture Research System (CARS-48), Program of Shandong Leading Talent (LNJY2015002), and Science and Technology Innovation Project of Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02)]. 許 楊，E-mail: aspenxy@163.com

李 健，研究員，E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

2017-03-28,

2017-04-28

許楊, 王佳佳, 葛倩倩, 崔彥婷, 馬驪, 李健. 脊尾白蝦基因克隆及、和在不同蛻皮分期的表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(4): 110–118

Xu Y, Wang JJ, Ge QQ, Cui YT, Ma L, Li J. Cloning ofgene and expression analysis of,andduring different molting stages of. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(4): 110–118