杜愛(ài)林 王昊陽(yáng) 代 玄 侯佳寶 張向陽(yáng) 羅曉秋 張瑞嶺

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室 中英腦功能損傷聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 河南省高校腦研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，河南 新鄉(xiāng) 453003)

慢性酒精中毒是長(zhǎng)期過(guò)量飲酒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，表現(xiàn)為患病個(gè)體對(duì)酒的強(qiáng)烈渴求，并且在停止飲酒后出現(xiàn)如出汗、震顫、嘔吐與坐立難安等癥狀?，F(xiàn)有研究表明，慢性酒精中毒會(huì)增加罹患心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，造成腦部神經(jīng)元的損傷且導(dǎo)致個(gè)體學(xué)習(xí)記憶能力的減退〔1〕。丁苯酞(NBP)作為我國(guó)自主開(kāi)發(fā)的一類創(chuàng)新性藥物，為人工合成的消旋體，其左旋體存在于芹菜種子中。研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，其能夠抑制Ca2+內(nèi)流，保護(hù)線粒體，影響腦能量代謝和缺血腦區(qū)的微循環(huán)和血流量，改善受損中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。 本實(shí)驗(yàn)觀察高、中、低劑量的NBP對(duì)慢性酒精中毒大鼠的影響，并測(cè)定海馬硫化氫(H2S)含量及CA1、CA3區(qū)5-羥色胺(5-HT)的陽(yáng)性結(jié)果表達(dá)情況，探討NBP對(duì)慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦部海馬區(qū)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 90只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體重120～160 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物管理中心提供，實(shí)驗(yàn)前在22～25℃實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)5～7 d以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)，NBP低劑量組(NL組)、NBP中劑量組(NM組)、NBP高劑量組(NH組)、慢性酒精中毒模型組(M組)，每組18只。

1.2儀器與試劑 超低溫冰箱由美國(guó)Thermo Forma公司提供；高速冷凍離心機(jī)由德國(guó)Heraeus公司生產(chǎn)；Eclipse E200顯微鏡由日本Nikon公司提供；Bio-Tek ELx800酶標(biāo)儀由美國(guó)Bio-Tek公司生產(chǎn)； NaHS由美國(guó)ACROS公司提供；5-HT系北京博奧森有限公司生產(chǎn)；H2S測(cè)定試劑由鄭州九是公司提供；SP檢測(cè)試劑盒與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒由中杉金橋公司生產(chǎn)。

1.3模型建立 除NC組外，各組飲含6%(V/V)酒精水溶液42 d，酒精溶液每日9∶00配制，置換。28 d后，NBP用植物油稀釋后每日灌胃1次，劑量設(shè)定為NL組NBP 10 mg/kg，NM組NBP 20 mg/kg，NH組NBP 40 mg/kg，NC組等劑量植物油灌胃5 ml/kg(大約14 d)。

1.4學(xué)習(xí)和記憶能力評(píng)價(jià) 各組進(jìn)行Y型電迷宮測(cè)試〔3〕，Y型電迷宮分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個(gè)臂，隨機(jī)選擇作為安全區(qū)。每臂頂端設(shè)立一個(gè)信號(hào)燈，燈亮后提示此臂為安全區(qū)。所有學(xué)習(xí)記憶測(cè)試均在晚間暗光、安靜下進(jìn)行，將大鼠置于迷宮中，并打開(kāi)3條臂的指示燈，讓其適應(yīng)環(huán)境，適應(yīng)3 min后將燈熄滅。隨機(jī)打開(kāi)其中一臂的指示燈，指示燈不亮的兩臂自動(dòng)延遲5 s后通電電擊大鼠，直至大鼠逃避到安全區(qū)為止，然后燈亮持續(xù)15 s后熄滅，完成1次測(cè)試。大鼠在10 s內(nèi)一次直接逃至安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯(cuò)誤反應(yīng)。以10次電刺激后有9次做出正確反應(yīng)為學(xué)會(huì)，用大鼠作出正確反應(yīng)所需訓(xùn)練的次數(shù)來(lái)表示其空間分辨反應(yīng)的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)，訓(xùn)練次數(shù)越少，說(shuō)明大鼠學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。

1.5分光光度法間接測(cè)定海馬組織中H2S的含量 采用亞甲藍(lán)分光光度法〔4〕。各組均隨機(jī)抽取8只大鼠取腦組織，用研磨管在-20℃溫度下進(jìn)行研磨，倒入5 ml玻璃試管中，用冰預(yù)冷的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0)勻漿(1.2 g/L)，12 000 r/min，4℃，離心10 min，之后，取0.1 ml上清液移至另一離心管中，在室溫下加入1%醋酸鋅0.5 ml，振蕩混勻，孵育10 min。然后依次加入20 mmol/L N，N-二甲基苯二胺0.5 ml及30 mmol/L三氯化鐵0.5 ml，室溫孵育20 min使之充分顯色。再加入10%三氯乙酸1 ml和三蒸水2.5 ml使反應(yīng)終止。再次離心(6 000 r/min，4℃，10 min)，收集清澈的上清液。使用美國(guó)Bio-Tek ELx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)670 nm處測(cè)定上清液吸光度，根據(jù)H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中的H2S含量，海馬組織中硫化氫含量以單位重量的組織H2S量(nmol/g)表示。

1.6免疫組化測(cè)定5-HT含量 每組隨機(jī)選取8只大鼠用作免疫組化檢測(cè)，取腦、固定、包埋、切片。石蠟切片經(jīng)脫蠟復(fù)水后，進(jìn)行免疫組化，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察并攝片。在高倍顯微鏡(400×)下每張切片隨機(jī)攝取雙側(cè)海馬CA1、CA3區(qū)各4個(gè)視野圖片，用image-pro-plus 6.0 圖像處理軟件對(duì)5-HT的陽(yáng)性表達(dá)情況進(jìn)行分析，取其平均光密度值判斷5-HT的陽(yáng)性表達(dá)。5-HT受體蛋白定位于細(xì)胞膜部位，陽(yáng)性細(xì)胞顯示棕黃色。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組學(xué)習(xí)記憶成績(jī) M組與NC組比較學(xué)習(xí)和記憶能力降低，表現(xiàn)為學(xué)會(huì)空間分辨所需訓(xùn)練次數(shù)顯著增高(P<0.01)；與M組相比，NM、NH組訓(xùn)練次數(shù)顯著減少(P<0.01)；NL組與M組學(xué)習(xí)記憶能力無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2海馬組織中H2S含量變化 M組與NC組相比，海馬組織內(nèi)H2S含量明顯增高(P<0.01)；NL組與M組比較，海馬組織內(nèi)H2S差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；NM、NH組與M組相比，海馬組織中H2S含量均顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.3光鏡觀察海馬組織中5-HT受體蛋白表達(dá) 各組海馬CA1、CA3區(qū)均可見(jiàn)一定量5-HT受體陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞著色較深，呈棕黃色。與NC組相比，其余4組5-HT受體陽(yáng)性表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，其中M組降低最明顯。NM、NH組與M組比較，5-HT受體陽(yáng)性表達(dá)明顯升高(P<0.01)；NL組與M組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1和圖1。

表1 各組學(xué)習(xí)記憶能力、海馬組織H2S含量、CA1、CA3區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值比較

與NC組比較：1)P<0.01；與M組比較：2)P<0.01

圖1 各組海馬CA1、CA3區(qū)免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞(×400)

3 討 論

長(zhǎng)期過(guò)量飲酒是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，慢性酒精中毒可以對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能造成嚴(yán)重?fù)p害，引起學(xué)習(xí)記憶方面的認(rèn)知功能障礙〔1〕。本研究提示，NBP能減輕慢性酒精中毒大鼠所致的記憶力下降，提高學(xué)習(xí)記憶能力。

H2S是新發(fā)現(xiàn)的一種氣體信號(hào)分子，腦內(nèi)含硫氨基酸代謝生成半胱氨酸，之后經(jīng)酶的催化作用生成H2S。有研究〔5〕發(fā)現(xiàn)H2S通過(guò)提高谷胱甘肽含量激活Cl-通道及增強(qiáng)谷氨酸攝取，生理濃度的H2S可調(diào)節(jié)突觸傳遞，能夠?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)中的多種氧化性物質(zhì)及時(shí)清除，進(jìn)而減輕氧化損傷〔6〕。而高濃度的內(nèi)源性H2S會(huì)通過(guò)抑制細(xì)胞色素C氧化酶來(lái)抑制細(xì)胞的呼吸活動(dòng)，進(jìn)而損害神經(jīng)細(xì)胞〔7〕。胱硫醚-β-合成酶(CBS)是參與內(nèi)源性H2S合成過(guò)程的重要酶之一，它主要分布于海馬、腦干、皮層等結(jié)構(gòu)中。慢性酒精攝入可以使海馬區(qū)中N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)表達(dá)上調(diào)〔8〕，導(dǎo)致Ca2+大量?jī)?nèi)流，激活鈣離子/鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而激活CBS，增加內(nèi)源性H2S的合成表達(dá)。慢性酒精中毒導(dǎo)致線粒體腫脹，正常功能受限，H2S含量增加、乙醛毒性與線粒體功能障礙引發(fā)脫髓鞘病變〔9〕密切相關(guān)，使信息在海馬各區(qū)之間的突觸環(huán)路傳導(dǎo)受到阻滯，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力的降低。本研究提示，通過(guò)藥物干預(yù)影響內(nèi)源性H2S的表達(dá)量可能為NBP治療慢性酒精中毒的機(jī)制之一 。

5-HT作為參與學(xué)習(xí)記憶調(diào)控的一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，可以促進(jìn)腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的分化，參與海馬區(qū)主管的認(rèn)知過(guò)程〔10〕。已有明確證據(jù)表明5-HT對(duì)酒精中毒有影響并且乙醇處理導(dǎo)致大鼠腦中5-HT能體系5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體(SERT)和5-HT表達(dá)降低〔11〕。酒精可以刺激5-HT系統(tǒng)，增加5-HT能神經(jīng)元的放電頻率，引起情緒差、沖動(dòng)攻擊、對(duì)酒精反應(yīng)降低等癥狀。5-HT神經(jīng)元產(chǎn)生于中腦神經(jīng)核，是慢性酒精中毒最主要的解剖基礎(chǔ)。酒精所致的欣快感與中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)的功能狀況上調(diào)有關(guān)，而5-HT系統(tǒng)可以通過(guò)對(duì)中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)(MLDS)的抑制作用來(lái)減輕慢性酒精中毒癥狀，MLDS包括伏隔核、腹側(cè)被蓋區(qū)、杏仁核、額前皮質(zhì)及海馬等腦區(qū)。研究表明在細(xì)胞膜上，5-HT可明顯減弱谷氨酸(Glu)誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)向電流，提高過(guò)量Glu作用下海馬神經(jīng)細(xì)胞的存活率〔11〕。本研究提示，NBP治療慢性酒精中毒的機(jī)制之一可能與提高海馬區(qū)域5-HT含量有關(guān)。

眾所周知，海馬是一個(gè)與學(xué)習(xí)記憶功能及情感等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)密切相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)，在海馬內(nèi)部存在著明確的突觸通路。Papez 環(huán)路和三突觸環(huán)路〔12〕是與海馬緊密相關(guān)的兩大通路。前者以海馬為中心環(huán)節(jié)，將丘腦乳頭體、丘腦前核、扣帶回及海馬聯(lián)系在一起，使沖動(dòng)在回路中循環(huán)往復(fù)，形成短時(shí)記憶的基礎(chǔ)。后者則由內(nèi)嗅皮層發(fā)出穿通纖維至齒狀回顆粒細(xì)胞，接著經(jīng)苔蘚纖維將沖動(dòng)傳至CA3區(qū)錐體細(xì)胞層，再經(jīng)由CA3區(qū)發(fā)出的Schaffer側(cè)支將沖動(dòng)送達(dá)CA1區(qū)錐體細(xì)胞層。本實(shí)驗(yàn)提示大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能可能與海馬CA1和CA3區(qū)5-HT受體蛋白的表達(dá)有關(guān)。綜上，H2S作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在慢性酒精中毒中發(fā)揮重要作用，酒精可導(dǎo)致NMDAR上調(diào)，受體門控鈣通道開(kāi)放，Ca2+內(nèi)流增多，導(dǎo)致內(nèi)源性H2S生成量增加。超過(guò)生理濃度的內(nèi)源性H2S通過(guò)增強(qiáng)NMDAR介導(dǎo)的鈣超載，造成線粒體腫脹損傷，引起能量代謝障礙，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡〔13〕。用乙醇處理過(guò)的大鼠，腦部5-HT能體系被抑制且5-HT表達(dá)降低，而5-HT系統(tǒng)可以通過(guò)對(duì)MLDS的抑制作用來(lái)減少酒精中毒癥狀，并且一定濃度的5-HT可減弱Glu誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)向電流，借此減輕過(guò)量Glu神經(jīng)毒性的作用〔11〕。本研究提示，NBP對(duì)慢性酒精中毒癥狀的改善可能是影響海馬內(nèi)H2S及CA1、CA3區(qū)5-HT表達(dá)量的結(jié)果。