嚴(yán)正杰 戴有金 侯道榮

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,江蘇 南京 210029)

我國已步入老齡化社會，預(yù)計10年內(nèi)中國將有超過2.7億婦女進入絕經(jīng)期，即女性卵巢功能的全面衰退〔1〕。由此將引發(fā)嚴(yán)重的圍絕經(jīng)期癥狀和諸多老年性疾病，如心血管疾病、骨質(zhì)疏松、老年性癡呆、腫瘤、肥胖等〔2〕。圍絕經(jīng)期綜合征多采用激素替代療法(HRT)有禁忌證和潛在致癌危險。中醫(yī)藥因其具有全身調(diào)理作用及較小的毒副作用而在該領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景〔3〕。姜黃素是從植物姜黃根莖中提取出來的一種可食用的酚類色素。研究表明〔4～6〕，姜黃素具有很強的抗氧化、抗衰老和抗炎癥活性，但其對女性生殖內(nèi)分泌、卵巢功能和氧化應(yīng)激方面的影響未見報道，本研究探討姜黃素對D-半乳糖(gal)致衰老雌性小鼠卵巢功能的影響。

1 材料與方法

1.1動物 雌性C57BL/6小鼠60只，體質(zhì)量(22±2)g，購自南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實驗動物中心。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK (蘇)2016-0002。飼養(yǎng)室溫度20～25℃。相對濕度40%～70%。實驗動物中心使用許可證號：〔SYXK (蘇)2013-0015〕。動物自由飲食并置于在室溫18～22℃，相對濕度65%，光照周期12 h∶12 h條件下飼養(yǎng)。

1.2藥品和儀器 姜黃素(Curcumin，2A-81025.1-5)，美國Cayman公司；D-gal(D-(+)Galactose，G0750)，美國Sigma 公司；P16抗體(ab81278)，美國Abcam公司；Trizol(B5704-1)和RT-PCR試劑盒(RR037A)，日本Takara 公司；引物，南京銳真生物公司；Q-PCR試劑盒，LC96，瑞士Roche 公司；Q-PCR儀，美國Applied Biosystems公司；全自動組織脫水機、包埋機，日本櫻花公司；雌激素(E2)和孕激素(P)檢測試劑盒，美國Cayman公司；丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.3動物分組和模型建立 60只C57BL/6小鼠隨機分為空白對照組、D-gal組和姜黃素組，每組20只。D-gal組頸部皮下注射D-gal(100 mg·kg-1·d-1)〔7〕；姜黃素組在D-gal注射造模的同時腹腔注射姜黃素(100 mg·kg-1·d-1)〔5，8〕；空白對照組頸部皮下注射相同體積生理鹽水；1次/d，6 w后取各組血清和卵巢做相關(guān)檢測。

1.4始基卵泡計數(shù) 卵巢固定包埋后，沿縱軸行連續(xù)切片，厚度為4 μm，每5片貼于一張載玻片上。取標(biāo)號為奇數(shù)的切片進行采用蘇木精-伊紅(HE)染色后由兩人參考Tilly〔9〕方法，對始基卵泡進行計數(shù)。各級卵泡形態(tài)特點為：始基卵泡，每個卵母細胞周圍有一層扁平的顆粒細胞；初級卵泡，每個卵母細胞周圍一層或多層立方形顆粒細胞；次級卵泡，每個卵母細胞周圍增至6～12 層立方形顆粒細胞；竇狀卵泡，多層顆粒細胞，卵泡出現(xiàn)明顯的竇腔。

1.5血清E2和P檢測 采用陰道涂片法觀察小鼠動情期，在小鼠動情前期眼眶取血，離心，分離血清，按ELISA試劑盒說明書檢測血清中E2和P水平。

1.6卵巢組織SOD和MDA檢測 每組小鼠處死后，迅速打開腹腔取出卵巢組織，準(zhǔn)確稱取重量。在冰盤上用冷生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙拭干，放在小燒杯中按重量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例加入冷生理鹽水，然后在冰上用眼科小剪刀盡快剪碎組織，放入勻漿管，補足冷生理鹽水制成組織勻漿。組織勻漿4℃離心10 min(3 000 r/min)，取上清液進行SOD活性、MDA含量測定。具體操作方法按試劑盒說明書進行。

1.7卵巢組織抗苗勒管激素(AMH)、SOD2和過氧化氫酶(CAT)mRNA的表達 在1.5 ml無RNA酶離心管中將卵巢組織剪碎后，使用超聲研磨機制成組織勻漿。使用Trizol裂解細胞并抽提組織RNA。參照RT-PCR試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA用于目的基因PCR擴增。利用Applied Biosystems realtime PCR連續(xù)熒光檢測系統(tǒng)擴增，程序設(shè)定為預(yù)變性95℃，2 min；變性95℃，10 s；退火溫度，20 s；延伸72℃ 20 s；共40個循環(huán)。于72℃處收集熒光。以每個樣本在同一批反應(yīng)的GAPDH為內(nèi)參照。各基因引物序列見表1。采用GraphPad Prism5軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。

表1 RT-PCR引物列表

1.8Western印跡檢測 取出-80℃條件下保存的卵巢組織，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作提取蛋白，將得到的蛋白在-80℃條件下保存待用。上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%胎牛血清封閉，先后加入P16一抗和辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗。增強化學(xué)發(fā)光法顯色，每組重復(fù)3次。采用Bio-RAD公司的凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0 統(tǒng)計軟件行單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1血清E2、P和卵巢組織MDA、SOD水平 D-gal組較空白對照組血清E2、P及卵巢組織SOD水平明顯下降(P<0.01)，卵巢組織MDA則明顯上升(P<0.01)；與D-gal組比較，姜黃素組血清E2和P及卵巢組織SOD水平顯著上升(P<0.05)，卵巢組織MDA則顯著下降(P<0.01)。見表2。

表2 各組血清P和E2水平和卵巢組織勻漿MDA和SOD水平比較

與空白對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與D-gal組比較：3)P<0.05,4)P<0.01；下表同

2.2卵巢始基卵泡計數(shù) 與空白對照組(27.78±2.58)比較，D-gal組卵巢始基卵泡計數(shù)(16.34±1.45)顯著減小(P<0.01)，而姜黃素組(20.65±1.82)較D-gal組顯著上升(P<0.05)。

2.3卵巢組織AMH、CAT和SOD2 mRNA的表達 與空白對照組相比，D-gal組AMH mRNA表達顯著下降而CAT mRNA和SOD2 mRNA表達顯著升高(P<0.01)；與D-gal組比較，姜黃素組AMH mRNA表達顯著升高(P<0.05)，而CAT mRNA和SOD2 mRNA表達顯著下降(P<0.05和P<0.01)。見表3。

2.4卵巢組織P16蛋白檢測 蛋白P16在空白對照組表達較低，在D-gal組表達最高，而姜黃素組相對于D-gal組明顯降低。見圖1。

表3 各組卵巢AMH、CAT、SOD2 mRNA表達

圖1 各組P16蛋白在卵巢組織中表達

3 討 論

卵巢的發(fā)育和衰老是一個多因素調(diào)控的復(fù)雜過程〔8〕，并且卵巢的衰老速度比身體其他器官要更快。卵巢衰老主要表現(xiàn)在卵泡數(shù)量和質(zhì)量逐漸下降，這是一個多因素相互作用、逐漸累積的復(fù)雜生物過程〔10〕。目前對機體衰老最有力的解釋來自于“自由基”衰老理論。這一理論由Harman〔11〕首先提出。自由基是指細胞內(nèi)正常代謝產(chǎn)生的活性氧簇等，其可對細胞內(nèi)生物大分子等攻擊進而引起的細胞功能缺陷。有研究表明〔12，13〕，細胞內(nèi)氧化應(yīng)激壓力升高是造成細胞衰老的主要原因。D-gal可在D-gal氧化酶的作用下生成乙醛糖和過氧化氫，使活性氧增多，脂質(zhì)過氧化亢進，產(chǎn)生過量的超氧陰離子自由基，進而導(dǎo)致機體衰老〔14〕，且能引發(fā)卵巢早衰〔15〕。女性生殖衰老的實質(zhì)是卵巢衰老，其核心觀點是卵巢中始基卵泡數(shù)量逐漸減少、卵母細胞質(zhì)量逐漸下降〔16〕。卵泡數(shù)量減少是卵巢衰老的主要特征之一，因此卵泡生長情況是檢測卵巢衰老的一個重要指標(biāo)〔17〕，始基卵泡下降是卵巢衰老最顯著特點〔18〕。本研究D-gal表明姜黃素能抑制D-gal對卵母細胞和原始卵泡的破壞作用，加快卵母細胞巢破裂，促進始基卵泡形成并抑制卵母細胞凋亡，維持其儲備量；與陳振國等〔8〕研究結(jié)果一致。

婦女進入中年以后，卵巢功能逐步衰退，雌激素分泌減少。E2和P是反映性激素水平的經(jīng)典指標(biāo)。在絕經(jīng)期女性中，內(nèi)分泌紊亂，卵巢功能衰退，E2和P明顯降低〔19〕。本研究D-gal導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)了卵巢老化的狀態(tài)，姜黃素能夠抑制卵巢活性氧自由基反應(yīng)，調(diào)節(jié)機體生殖內(nèi)分泌功能，延緩卵巢的衰退。AMH是由生長卵泡即初級卵泡和小竇狀卵泡的顆粒細胞分泌，可調(diào)節(jié)卵泡的生長。研究發(fā)現(xiàn)〔20〕，AMH在血清中含量隨增齡逐漸下降，在絕經(jīng)前5～15年，AMH水平呈對數(shù)級下降，直至低到不可測定；同時由于AMH在月經(jīng)周期的不同時期表達水平相對不變。因此目前認(rèn)為AMH能夠作為卵巢始基卵泡池大小的標(biāo)志〔21〕。根據(jù)自由基理論，由活性氧等引起的細胞內(nèi)氧化損傷是造成衰老的重要因素〔22〕?？寡趸赶等纾篠OD2和CAT是體內(nèi)最重要的兩種抗氧化酶，其表達量隨著氧化應(yīng)激壓力升高而升高。SOD2 將超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化物，而緊接著由CAT將過氧化物轉(zhuǎn)化為水〔23〕。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠改善卵巢功能并且緩解卵巢的氧化應(yīng)激壓力。研究表明〔24〕，P16與細胞衰老有著緊密聯(lián)系，P16的過量表達會誘導(dǎo)細胞發(fā)生提前衰老，這也是P16抑制腫瘤發(fā)生的機制，目前認(rèn)為P16可以作為組織和細胞衰老的標(biāo)志。P16誘導(dǎo)衰老的分子機制是P16作為細胞周期依賴性激酶抑制因子，使細胞周期停滯而發(fā)生衰老。P16基因表達增高，能夠抑制cyclinDl、CDK4的活性，使靶蛋白不能磷酸化。未磷酸化或低磷酸化的Rb蛋白能夠與多種蛋白結(jié)合，其中E2F被Rb蛋白結(jié)合時，不能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，其活性處于被抑制狀態(tài)，導(dǎo)致細胞由G1期進入S期停滯〔25〕。在多種細胞系中亦觀察到P16表達和衰老及細胞氧化應(yīng)激壓力相關(guān)〔26，27〕。P16蛋白在青年動物組織內(nèi)表達較少，隨著年齡增長其表達量亦隨之上升。本研究表明姜黃素抑制了D-gal引起的小鼠卵巢P16蛋白增高，對D-gal所致小鼠卵巢的衰老具有明顯抑制作用。

本研究結(jié)果表明，姜黃素具有較強的抗卵巢衰老作用，但其對小鼠繁殖性能的影響及抗卵巢衰老的具體作用機制還有待進一步研究。