賈留坤 焦秀潔 劉海瑞 李 彥 更吉卓瑪 王智華 高慶波

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所中國(guó)科學(xué)院高山植物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039； 3.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所信息與學(xué)報(bào)編輯部，西寧 810001； 4.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001)

自Avise于1987年提出譜系地理學(xué)概念(phylogeography)[1]，經(jīng)過(guò)40多年發(fā)展，該學(xué)科已成為生物地理學(xué)的一個(gè)重要分支。譜系地理學(xué)借助分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛應(yīng)用直接測(cè)序來(lái)檢測(cè)核DNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和葉綠體DNA非編碼區(qū)的序列變異[2]，將微觀進(jìn)化與宏觀進(jìn)化相結(jié)合，研究物種現(xiàn)有遺傳分布格局的歷史成因，從進(jìn)化歷程、時(shí)間和空間尺度的動(dòng)態(tài)變化等方面重建生物區(qū)系進(jìn)化歷史[3～4]。

青藏高原是世界上平均海拔最高的地區(qū)，該區(qū)域地理結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生境多樣、生態(tài)位分化明顯，具有較高的生物多樣性，是世界生物多樣性熱點(diǎn)地區(qū)[5]，且擁有大量的特有種，是世界上特有種密度最高的地區(qū)之一[6]。青藏高原的快速隆升被認(rèn)為對(duì)高原物種分化產(chǎn)生了重要影響，使得該區(qū)域成為研究高山植物適應(yīng)性進(jìn)化的理想地區(qū)，相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)在該地區(qū)的特色類(lèi)群如虎耳草屬(SaxifragaL.)[7]、馬先蒿屬(PedicularisL.)[8]、風(fēng)毛菊屬(SaussureaDC.)[9]、紅景天屬(RhodiolaL.)[10]中均能檢測(cè)到明顯的快速輻射分化。由于復(fù)雜的地理拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和獨(dú)特的地形，青藏高原在末次盛冰期受到的影響與歐洲和北美大陸不同，未形成統(tǒng)一的大冰蓋[11]，使得該地區(qū)植物對(duì)于第四紀(jì)冰期的響應(yīng)呈現(xiàn)出不同的譜系地理模式。“退縮—回遷”模式認(rèn)為，高原臺(tái)面上的居群在冰期時(shí)退縮到高原邊緣，冰期后或間冰期再由避難所遷移至高原臺(tái)面，如祁連圓柏(Juniperusprzewalskii)[12]、青海云杉(Piceacrassifolia)[13]、長(zhǎng)花馬先蒿(Pedicularislongiflora)[14]、窄葉鮮卑花(Sibiraeaangustata)[15]等類(lèi)群的譜系地理研究結(jié)果符合該模式。通常，符合“退縮—回遷”模式的物種，一般在高原邊緣的避難所內(nèi)擁有較多的單倍型和較高的遺傳多樣性，由于回遷過(guò)程中受到奠基者效應(yīng)影響，高原臺(tái)面上僅固定少數(shù)單一的單倍型，并呈現(xiàn)出較低的遺傳多樣性。“微型避難所”模式認(rèn)為，某些耐寒的植物在冰期時(shí)并未退縮到高原邊緣，而是在高原臺(tái)面若干個(gè)相互隔離的微型避難所內(nèi)保留下來(lái)，在冰期后或間冰期時(shí)，從避難所向周邊擴(kuò)散，并由于地理阻隔而發(fā)生不同程度的異域分化，該模式的代表物種包括菊葉紅景天(Rhodiolachrysanthemifolia)[16]、唐古特虎耳草(Saxifragatangutica)[17]、西藏沙棘(Hippophaetibetana)[18]等。擁有微型避難所的物種一般擁有較多的特有單倍型和多個(gè)隨機(jī)分布的遺傳多樣性較高的居群。因此，研究青藏高原地區(qū)高山植物的進(jìn)化歷史不但可以為該地區(qū)植物遺傳資源的保護(hù)和利用提供理論基礎(chǔ)，也可為高原大規(guī)模隆升的時(shí)間尺度和第四紀(jì)冰期是否存在‘大冰蓋’等科學(xué)問(wèn)題提供間接證據(jù)。

虎耳草屬(SaxifragaLinnaeus)約有500種，主要分布于北半球高山地區(qū)。該屬起源于北美的落基山，向南擴(kuò)散到南美洲的安第斯山和火地島，在北部經(jīng)白令海峽擴(kuò)散到歐亞大陸[19]，分布范圍包括歐洲南部的阿爾卑斯山、高加索山，青藏高原地區(qū)，北極圈附近也有分布。我國(guó)有虎耳草屬植物216種，主要分布在青藏高原—喜馬拉雅地區(qū)[20]。為了適應(yīng)高原地區(qū)復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境，該屬植物在生活史、形態(tài)、生理特征等方面表現(xiàn)出極高的多樣性。已有研究表明，虎耳草屬植物的分化與青藏高原的隆升以及該地區(qū)復(fù)雜的地理結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此該屬植物被廣泛應(yīng)用于譜系地理學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究，來(lái)揭示北極和高山地區(qū)植物的分化式樣[21]。優(yōu)越虎耳草(SaxifragaegregiaEngl.)隸屬于虎耳草科(Saxifragaceae)虎耳草屬(SaxifragaLinnaeus)山羊臭組(sect.CiliataeHaw.)，為多年生草本，植株高9～32 cm?；~具長(zhǎng)柄，葉片多為心形、心狀卵形，邊緣具卷曲長(zhǎng)腺毛，最上部葉片披針形至長(zhǎng)圓形。多歧聚傘花序傘房狀，花梗被短腺毛。萼片在花期反曲，卵形至闊卵形，背面和邊緣具腺毛?；ò挈S色，花絲鉆形。子房近上位，卵球形，花期7～9月。主要分布于青藏高原邊緣地區(qū)密閉的林下、灌叢，海拔2 800～4 500 m。主要范圍包括甘肅南部、青海東部和南部、四川西部、云南西北部和西藏東部。模式標(biāo)本采自青海、甘肅交界的大通河流域[22]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究材料采集于2003～2012年，共計(jì)13個(gè)居群、151個(gè)個(gè)體。采集地點(diǎn)主要集中在青藏高原東南部的橫斷山地(表1，圖1)，包括青海省南部一個(gè)居群、西藏東部?jī)蓚€(gè)居群和四川西部10個(gè)居群。每個(gè)居群隨機(jī)采集3～24個(gè)個(gè)體，個(gè)體之間間隔10米以上，選取長(zhǎng)勢(shì)較好植株的新鮮幼嫩葉片，隨即用硅膠干燥，帶回實(shí)驗(yàn)室后放于-20℃冰箱中保存。憑證標(biāo)本館藏于中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館(HNWP)，并由Richard J. Gornall教授和高慶波副研究員共同鑒定。

表1優(yōu)越虎耳草13個(gè)居群的采集信息

Table1Samplinginformationof13populationsofS.egregia

居群Pop.憑證標(biāo)本Voucher采樣地Location地理坐標(biāo)Coordinates海拔Altitude(m)采樣數(shù)No.P1chen03026青海班瑪Banma,QinghaiN32°48'34″;E100°56'50″368019P2chen03075四川色達(dá)Seda,SichuanN31°52'02″;E100°41'23″336024P3chen03084四川康定Kangding,SichuanN30°15'17″;E101°30'37″355010P4chen06111四川紅原Hongyuan,SichuanN31°52'46″;E102°40'22″397015P5chen06242四川鄉(xiāng)城Xiangcheng,SichuanN30°41'11″;E97°15'42″338019P6chen06290四川雅江Yajiang,SichuanN30°09'38″;E100°40'45″429022P7chen2007049西藏類(lèi)烏齊Leiwuqi,XizangN31°14'23″;E96°33'56″38208P8chen2007202西藏昌都Changdu,XizangN31°24'27″;E97°28'13″36709P9chen2007219四川德格Dege,SichuanN31°57'21″;E98°51'48″41108P10chen2012252四川理塘Litang,SichuanN30°15'31″;E100°15'47″38903P11chen2012268四川道孚Daofu,SichuanN30°43'02″;E101°21'43″37706P12chen2012288四川爐霍Luhuo,SichuanN31°37'29″;E100°43'12″34704P13chen2012293四川壤塘Rangtang,SichuanN32°07'51″;E100°00'08″31404

圖1 優(yōu)越虎耳草cpDNA聯(lián)合片段19個(gè)單倍型地理分布圖 餅狀圖表示每個(gè)居群中單倍型的頻率Fig.1 Geographic distribution pattern of the 19 detected cpDNA haplotypes in S.egregia Pie charts show the proportions of haplotypes within each population.

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

采用改良的 CTAB法[23]，從硅膠干燥葉片中提取總DNA。用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)逐一檢測(cè)每個(gè)DNA樣品的質(zhì)量與濃度，并將所有樣品稀釋到50 ng·μL-1，用于隨后的PCR擴(kuò)增。采用通用引物分別對(duì)所有個(gè)體的cpDNArpl20-rps12和trnL-trnF兩個(gè)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增[24～25]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL：包含5 μL的10 × PCR Buffer(含1.5 mmol·L-1Mg2+)，2 μL的10 mmol·L-1dNTPs，5 pmol·L-1的正反引物各2 μL，0.4 μL的Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)，0.4 μL(約20 ng)的DNA模板，用雙蒸水補(bǔ)足到50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，32循環(huán)；72℃延伸10 min。取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。剩余的48 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行割膠純化并進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序所得序列首先用Chromas軟件和手工進(jìn)行核對(duì)，再將cpDNA兩個(gè)片段(rpl20-rps12和trnL-trnF)進(jìn)行串聯(lián)合并，用MEGA6.06軟件進(jìn)行對(duì)位排列，并加以手工校正[26]。用DnaSP 5.1軟件統(tǒng)計(jì)單倍型[27]。居群內(nèi)平均遺傳多樣性(average gene diversity within populations，Hs)，總的遺傳多樣性(total gene diversity，Ht)以及居群遺傳分化系數(shù)Gst和Nst均在軟件PERMUT中計(jì)算[28]。

用Arlequin 3.5.1.3軟件計(jì)算居群的遺傳多樣性(gene diversity，He)及核苷酸多樣性(nucleotide diversity，π)[29]，并用AMOVA(analysis of molecular variance)軟件檢測(cè)遺傳變異在居群間和居群內(nèi)的分布，并對(duì)Fst進(jìn)行評(píng)價(jià)，以進(jìn)一步揭示居群的分化程度(1 000次重復(fù)的顯著性檢驗(yàn))[30]。用軟件DnaSP 5.1進(jìn)行歧點(diǎn)分布分析，并在Arlequin 3.5.1.3軟件包中計(jì)算中性檢驗(yàn)Tajima’s D和Fu’sFs值[31～32]。

以最大簡(jiǎn)約法為原則，通過(guò)NETWORK 4.6.1.3構(gòu)建單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系圖[33]。構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖時(shí)包含了所有信息位點(diǎn)，插入/缺失和點(diǎn)突變?cè)O(shè)置相同的權(quán)重。在單倍型中央鏈接網(wǎng)絡(luò)圖中，年輕的單倍型發(fā)生在網(wǎng)絡(luò)圖的邊緣，古老的單倍型多存在于網(wǎng)絡(luò)圖的內(nèi)部[34]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單倍型變異位點(diǎn)和地理分布格局

對(duì)優(yōu)越虎耳草13個(gè)居群、151個(gè)個(gè)體cpDNA片段rpl20-rps12和trnL-trnF的測(cè)序結(jié)果串聯(lián)合并，對(duì)位排列后序列長(zhǎng)度為1 599 bp。通過(guò)DnaSP軟件分析，共得到19個(gè)單倍型(圖1)，檢測(cè)出36個(gè)變異位點(diǎn)(表2)。19種單倍型的頻率變化范圍為0.007～0.318；其中頻率最高的單倍型H2，在48個(gè)個(gè)體中出現(xiàn)；單倍型H6次之，在21個(gè)個(gè)體中出現(xiàn)；單倍型H11、H14、H15、H19分別只在一個(gè)個(gè)體中出現(xiàn)；其余單倍型則在2～15個(gè)個(gè)體中出現(xiàn)。在19個(gè)單倍型中，12個(gè)為居群特有單倍型。這些特有單倍型并未固定于某個(gè)區(qū)域，而是在優(yōu)越虎耳草自然分布范圍內(nèi)隨機(jī)分布。每個(gè)居群的遺傳多樣性(He)、核苷酸多樣性(π)、單倍型組成及頻率見(jiàn)表3。

2.2 單倍型間的系統(tǒng)關(guān)系

最大簡(jiǎn)約法(Maximum parsimony,MP)、最大似然法(Maximum likelihood,ML)和貝葉斯法(Bayesian inference,BI)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)均沒(méi)有很好地揭示出優(yōu)越虎耳草各單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，可能是由于優(yōu)越虎耳草各單倍型之間的分歧時(shí)間較短，沒(méi)有積累足夠的變異所致。NETWORK軟件能更好的揭示分化較淺的序列之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，于是我們利用最大似然法對(duì)優(yōu)越虎耳草19個(gè)單倍型構(gòu)建中央鏈接網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。結(jié)果顯示，出現(xiàn)頻率最高的單倍型H2位于網(wǎng)絡(luò)圖的中心位置，推測(cè)H2為古老的單倍型。居群特有單倍型一般位于網(wǎng)絡(luò)圖的邊緣，可能是通過(guò)近期輻射分化衍生而來(lái)的年輕單倍型。

2.3 居群的遺傳結(jié)構(gòu)

利用PERMUT軟件對(duì)優(yōu)越虎耳草19個(gè)單倍型進(jìn)行分析得到居群內(nèi)平均遺傳多樣性(Hs)為0.466，總的遺傳多樣性(Ht)為0.868，居群間遺傳分化Gst值和Nst值分別為0.438和0.463。使用U-統(tǒng)計(jì)方法對(duì)優(yōu)越虎耳草整個(gè)分布區(qū)單倍型變異的地理分布模式進(jìn)行檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)Nst大于Gst，但不顯著(P>0.05)，表明優(yōu)越虎耳草在其現(xiàn)有分布區(qū)域內(nèi)沒(méi)有明顯的譜系地理學(xué)結(jié)構(gòu)。分子變異分析(AMOVA)顯示，居群內(nèi)遺傳變異為57.37%，居群間遺傳變異為42.63%(表4)，表明優(yōu)越虎耳草cpDNA聯(lián)合片段的遺傳變異主要存在于居群內(nèi)(Fst=0.426；P<0.001，1,000次重復(fù)的顯著性檢驗(yàn))。

表2 優(yōu)越虎耳草2個(gè)cpDNA片段19種單倍型進(jìn)行序列比對(duì)后的變異位點(diǎn)

注：序列順序?yàn)?′-3′ 表中的數(shù)字表示：1. TTATTATTATGTATACGTA; 2. AAATACTATATAAAAAT; 3. AATTATTA; 4. ACTAAAAAAAAA; 5. AAAAAAG; 6. AA; 7. AAAA; 8. TTTTT; 9. TTTT; 10. ATTAATC; 11. TTTGACTCCTTTTGACTCCT; 12. AACTAT; 13. CCTATACTTCAATT; 14. CCTATACTTCAAATT; 15. TATATA; 16. TTCCTGCAT; 17. CCCTA; 18. TCCTA; 19. ATTCATATTCTATTTCTATCCT; 20. ATTCATATTCTATTTCTATCCTA; 21. ATTCATATTCTATTTCTAGCCT; 22. ATTCATATTCGATTTCTATCCT

Note:Sequences are numbered from 5′-3′ end Representations of No. in the table are as follows: 1. TTATTATTATGTATACGTA; 2. AAATACTATATAAAAAT; 3. AATTATTA; 4. ACTAAAAAAAAA; 5. AAAAAAG; 6. AA; 7. AAAA; 8. TTTTT; 9. TTTT; 10. ATTAATC; 11. TTTGACTCCTTTTGACTCCT; 12. AACTAT; 13. CCTATACTTCAATT; 14. CCTATACTTCAAATT; 15. TATATA; 16. TTCCTGCAT; 17. CCCTA; 18. TCCTA; 19. ATTCATATTCTATTTCTATCCT; 20. ATTCATATTCTATTTCTATCCTA; 21. ATTCATATTCTATTTCTAGCCT; 22. ATTCATATTCGATTTCTATCCT

表3 優(yōu)越虎耳草13個(gè)居群的遺傳多樣性、核苷酸多樣性和單倍型組成

圖2 優(yōu)越虎耳草19個(gè)單倍型的中央鏈接網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Median-joining network for the 19 detected haplotypes in S.egregia

表4優(yōu)越虎耳草13個(gè)居群的分子遺傳變異(AMOVA)分析結(jié)果

Table4Analysisofmolecularvariation(AMOVA)forthe13populationsofS.egregia

變異來(lái)源Source of variation自由度Degrees總方差Sum of squares變異成分Variation component變異比例Variation(%)居群間Among populations1275.2100.4970942.63居群內(nèi)Within populations13892.3020.6688557.37總計(jì)Total150167.5121.16595固定系數(shù)Fixation index(Fst)Fst=0.426(P< 0.001)

2.4 居群的歷史動(dòng)態(tài)

在優(yōu)越虎耳草13個(gè)居群中，有11個(gè)存在居群內(nèi)遺傳分歧(intra-population divergence)，對(duì)所有測(cè)序成功的個(gè)體和具有居群內(nèi)遺傳分歧的居群進(jìn)行中性檢驗(yàn)，在整個(gè)分布范圍內(nèi)，Tajima’s D和Fu’s Fs值均不顯著，表明優(yōu)越虎耳草在整體水平上沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)近期擴(kuò)張。在居群水平上，只有居群P3的Tajima’s D為顯著負(fù)值，其余居群的兩個(gè)中性檢驗(yàn)值均不顯著，表明優(yōu)越虎耳草在居群水平上也沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)近期擴(kuò)張(表5)。利用Arlequin軟件進(jìn)行歧點(diǎn)分布分析，結(jié)果表明優(yōu)越虎耳草在整個(gè)分布范圍內(nèi)SSD值(0.041 8)和Raggedness index值(0.039 0)均顯著，表明該物種在整個(gè)分布范圍內(nèi)未經(jīng)歷過(guò)近期擴(kuò)張，這與中性檢驗(yàn)結(jié)果一致。在居群水平上，居群P1、P2、P3、P5、P7、P9和P11實(shí)際觀測(cè)到的歧點(diǎn)分布與期望的居群擴(kuò)張模型可以顯著分開(kāi)，表明這7個(gè)居群沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)大規(guī)模的居群近期擴(kuò)張；居群P4、P6、P8、P10則不能排除經(jīng)歷過(guò)近期居群擴(kuò)張(表5，圖3)。

表5優(yōu)越虎耳草151個(gè)個(gè)體及具有居群內(nèi)遺傳變異的11個(gè)居群cpDNA聯(lián)合片段中性檢驗(yàn)、歧點(diǎn)分布分析結(jié)果

Table5Resultsoftheneutralitytestsandmismatchdistributionanalysisforthe151individualsandthe11populationswhichhaveintra-populationdifferentiation,usingthecpDNAcombinedfragmentsofS.egregia

Population codeTajima’s DFu’s Fs*SSDRaggedness indexTotal individuals-1.3483218.915720.0418*0.0390*P11.8196829.364680.24610.4270*P22.0853721.079840.5444*0.7732P3-1.66706*8.858420.0577*0.7200P4-0.02381-0.064330.03330.2259P5-1.0109011.459430.5702*0.1128P6-0.641126.548050.01030.5634P70.4142110.019810.2483*0.6939P80.156471.724670.08250.1975P9-1.310095.547260.5332*0.4834P100.000002.210060.30170.6667P110.8505710.327100.5689*0.7867

注：*表示P>0.05

Note:*signP>0.05

圖3 優(yōu)越虎耳草151個(gè)個(gè)體cpDNA聯(lián)合片段歧點(diǎn)分布分析結(jié)果Fig.3 Mismatch distribution analysis for the 151 individuals based on the cpDNA combined fragments of S.egregia

3 討論

3.1 優(yōu)越虎耳草的居群遺傳結(jié)構(gòu)

通過(guò)遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)越虎耳草總的遺傳多樣性較高(Ht=0.868)，而居群內(nèi)平均遺傳多樣性較低(Hs=0.466)。居群遺傳結(jié)構(gòu)符合青藏高原地區(qū)植物普遍的遺傳變異類(lèi)型，如長(zhǎng)花馬先蒿(Pedicularislongiflora)[14]、露蕊烏頭(Aconitumgymnandrum)[35]、祁連圓柏(Juniperusprzewalskii)[12]、西藏沙棘(Hippophaetibetana)[18]、西川紅景天(Rhodiolaalsia)[36]、銀露梅(Potentillaglabra)[37]、Juniperustibeticacomplex[38]和沙棘(Hippophaerhamnoides)[39]等，均具有較高的總遺傳多樣性和較低的居群內(nèi)平均遺傳多樣性。cpDNA屬于母系遺傳，基因流主要通過(guò)種子傳播。優(yōu)越虎耳草為低矮草本，多生于郁閉林下和灌叢，且種子沒(méi)有有利于傳播的附屬結(jié)構(gòu)，傳播距離較近，使得基因流主要發(fā)生在居群內(nèi)，居群間基因流較低，最終使種內(nèi)遺傳分化增大，總的遺傳多樣性也較高，而居群內(nèi)遺傳多樣性較低。在優(yōu)越虎耳草中只有單倍型H2和H4在居群中廣泛分布，并有12個(gè)為居群特有單倍型，占比達(dá)63.2%。通常，特有單倍型比例較高的物種往往不能揭示出明顯的譜系地理格局[36～37,39]。本研究對(duì)優(yōu)越虎耳草的兩個(gè)遺傳分化系數(shù)Gst和Nst進(jìn)行1 000次的置換檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Nst>Gst(P>0.05)，但不顯著，表明優(yōu)越虎耳草在其分布范圍內(nèi)不存在明顯的譜系地理格局。此外，中央鏈接網(wǎng)絡(luò)圖顯示，居群特有單倍型一般位于網(wǎng)絡(luò)圖的邊緣，可能是通過(guò)近期輻射分化衍生而來(lái)的年輕單倍型，較高比例的年輕特有單倍型可能掩蓋了優(yōu)越虎耳草在整個(gè)分布范圍內(nèi)的譜系地理結(jié)構(gòu)。青藏高原地區(qū)特有單倍型比例較高的其他物種，如西川紅景天(Rhodiolaalsia)[36]，唐古特虎耳草(Saxifragatangutica)[17]等也未能揭示明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。

3.2 冰期避難所及居群進(jìn)化歷史的推測(cè)

通過(guò)對(duì)已有研究進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)與喜馬拉雅—橫斷山區(qū)復(fù)雜的地質(zhì)歷史以及氣候變化相對(duì)應(yīng)，該地區(qū)植物具有復(fù)雜多樣的進(jìn)化歷史[40]，其中可能存在的主要譜系地理模式有：冰期高原臺(tái)面的種群退縮到高原邊緣的避難所模式，其遺傳結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為遺傳多樣性由高原邊緣向高原臺(tái)面遞減，符合該進(jìn)化模式的物種其居群歷史一般是在冰期氣候寒冷的時(shí)候由高原臺(tái)面向高原東南部、東部的低海拔地區(qū)遷移，并在此得以保存，在間冰期或冰期后氣候回暖時(shí)再向高原臺(tái)面擴(kuò)散，回遷過(guò)程中受到奠基者效應(yīng)的影響，最終形成今天的譜系地理結(jié)構(gòu)；冰期高原臺(tái)面的種群退縮到本地避難所(含微型避難所)的模式，其遺傳結(jié)構(gòu)往往表現(xiàn)為特有單倍型和具有較高遺傳變異的居群在物種分布范圍內(nèi)均勻分布，符合該進(jìn)化模式的物種多為某些耐寒植物，第四紀(jì)冰期時(shí)并未遷移到高原邊緣，而是在高原臺(tái)面若干個(gè)彼此隔離的避難所保留下來(lái)，在間冰期或冰期后氣候回暖時(shí)從避難所向周邊擴(kuò)散，并且發(fā)生不同程度的異域分化。

本研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)越虎耳草符合“微型避難所”假說(shuō)。大量的特有單倍型在整個(gè)分布范圍內(nèi)隨機(jī)分布，遺傳多樣性和核苷酸多樣性較高的居群也呈均勻分布，沒(méi)有出現(xiàn)遺傳多樣性較高的某一區(qū)域，也沒(méi)有呈現(xiàn)遺傳多樣性由高原邊緣向高原臺(tái)面遞減的趨勢(shì)。根據(jù)歧點(diǎn)分布分析，在整體水平上SSD值和Raggedness index值均顯著，在居群水平上，P1、P2、P3、P5、P7、P9和P11也表現(xiàn)出顯著的SSD值和(或)Raggedness index值，可以將實(shí)際觀測(cè)到的歧點(diǎn)分布與期望的居群擴(kuò)張模型顯著分開(kāi)，表明居群沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)大規(guī)模的近期擴(kuò)張現(xiàn)象。在優(yōu)越虎耳草整體水平和居群水平進(jìn)行的中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Tajima’ D和Fu’s Fs值均不顯著，與歧點(diǎn)分布分析結(jié)果相似。綜合以上證據(jù)，我們推測(cè)優(yōu)越虎耳草在第四紀(jì)冰期時(shí)存在多個(gè)微型避難所。值得注意的是P2、P12、P13的單倍型多樣性明顯低于其他居群，只有P2具有顯著的SSD值，沒(méi)有經(jīng)歷近期的擴(kuò)張，即存在剩余兩個(gè)居群是由附近居群擴(kuò)散而來(lái)的可能性，在擴(kuò)散的過(guò)程中由于奠基者效應(yīng)，使得只有某一單倍型被保留了下來(lái)?；蚴沁@3個(gè)居群冰期時(shí)在該地保留下來(lái)，冰期結(jié)束后的擴(kuò)散過(guò)程中經(jīng)歷了嚴(yán)重的瓶頸效應(yīng)，在此過(guò)程中只有某一單倍型被保留，形成了今天的單倍型組成。

橫斷山區(qū)高山和大河交錯(cuò)分布，地理拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)復(fù)雜，被認(rèn)為是第三紀(jì)重要的物種分化中心，也被認(rèn)為是很多植物在冰期的重要避難所[13,41]。而優(yōu)越虎耳草主要分布在喜馬拉雅—橫斷山區(qū)，生于溫暖潮濕的林下。第四紀(jì)冰期時(shí)橫斷山區(qū)雖然沒(méi)有被大規(guī)模的冰川覆蓋，但寒冷干旱的冰期與溫暖濕潤(rùn)的間冰期交替發(fā)生，氣候的劇烈波動(dòng)導(dǎo)致橫斷山區(qū)木本植物分布范圍的多次縮小和擴(kuò)張。我們推測(cè)生于林下的優(yōu)越虎耳草的分布范圍也必然隨之發(fā)生變化，在此過(guò)程中居群不斷片段化，最終在相互隔離的“高山島嶼”中發(fā)生異域分化，使該物種產(chǎn)生了大量特有單倍型。

優(yōu)越虎耳草的主要生境為郁閉的林下及灌叢，然而到目前為止，青藏高原地區(qū)草本植物的譜系地理學(xué)研究中，對(duì)生境為灌叢或森林的涉及很少。而據(jù)我們的推測(cè)，優(yōu)越虎耳草應(yīng)該與同域分布的喬木或灌木具有相同或相近的譜系地理歷史。Opgenoort利用cpDNA作為分子標(biāo)記對(duì)與優(yōu)越虎耳草分布區(qū)重疊的Juniperustibeticacomplex(刺柏屬)進(jìn)行譜系地理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其特有單倍型比例(64.5%)、特有單倍型和具有較高遺傳多樣性的居群的分布與我們的研究結(jié)果相似[38]。Opgenoorth據(jù)此推測(cè)末次盛冰期時(shí)J.tibeticacomplex在青藏高原存在多個(gè)微型避難所，有些微型避難所的海拔超過(guò)了3 500 m，這也是已知最高的末次盛冰期樹(shù)線[38]。此外，西藏沙棘的譜系地理學(xué)研究揭示了相似的結(jié)果，該物種在第四紀(jì)冰期時(shí)同樣存在多個(gè)微型避難所，某些避難所海拔甚至超過(guò)了4 000 m[18]。由此我們可以推測(cè)，在第四紀(jì)冰期時(shí)如果某些喬木和灌木能在高原臺(tái)面的多個(gè)微型避難所生存下來(lái)，那么生于林下的優(yōu)越虎耳草也可能因?yàn)檫@些喬木或灌木提供的微型避難所而在冰期時(shí)保留下來(lái)。此外，另一個(gè)生長(zhǎng)于林下和灌叢的物種—菊葉紅景天(Rhodiolachrysanthemifolia)具有幾乎完全相同的譜系地理結(jié)構(gòu)。然而生于森林、灌叢下的草本植物與喬木和灌木之間是如何共同演化的，尚需進(jìn)一步研究。