白東義, 蘇日嘎，芒 來(lái)*,烏伊罕，趙一萍，李 蓓，格日樂(lè)其木格，張心壯,陶克濤,趙若陽(yáng),圖挌琴,青 柏,旭仁其木格

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬屬動(dòng)物研究中心，呼和浩特 010018； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)綜合疾病預(yù)防控制中心，呼和浩特010030)

肌鈣蛋白(troponin,Tn)是橫紋肌上的結(jié)構(gòu)蛋白，位于肌原纖維的細(xì)絲中[1]，同時(shí)也是與心肌和骨骼肌收縮相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白。肌鈣蛋白主要由肌鈣蛋白C(troponin C，TnC)、肌鈣蛋白I(troponin I，TnI)和肌鈣蛋白T(troponin T，TnT)3種不同的亞型組成。其中肌鈣蛋白C(Tnc)是肌鈣蛋白的鈣離子結(jié)合組分[2]。研究表明，肌鈣蛋白C對(duì)應(yīng)有兩種蛋白異構(gòu)型，即慢肌和心肌肌鈣蛋白C(cardiac and slow skeletal troponin C, cTnC)和快肌肌鈣蛋白[3]。兩種肌鈣蛋白異構(gòu)型由兩種不同的基因編碼，其中，cTnC是由TNNC1基因編碼，可以在骨骼肌和心肌中特定表達(dá)；快肌肌鈣蛋白C是由TNNC2基因編碼，能在骨骼肌中進(jìn)行表達(dá)[4]。在脊椎動(dòng)物中兩種亞型的肌鈣蛋白的區(qū)別在于：TNNC2被鈣離子激活于N-末端的低親和力鈣離子結(jié)合位點(diǎn)I和II，而TNNC1僅結(jié)合在低親和力的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)II[5]。

肌球蛋白輕鏈2(myosin light chain 2，MYL-2)是肌球蛋白輕鏈家族中的一員，為調(diào)節(jié)性輕鏈，對(duì)肌纖維的活性有調(diào)控作用[6]，進(jìn)而影響肌球蛋白重鏈上ATP 酶的活性，使肌纖維的類型發(fā)生轉(zhuǎn)化[7-8]，影響肌肉的生長(zhǎng)。研究者們對(duì)該基因及其蛋白的表達(dá)研究主要集中在心肌組織中。研究發(fā)現(xiàn)，MYL-2的突變和過(guò)量表達(dá)可導(dǎo)致人的心肌增生[9-10]，慢性心臟病患者的MYL-2表達(dá)量顯著低于正常人，而嚴(yán)重心臟病患者該基因的表達(dá)量顯著低于慢性心臟病患者[11]。成年人心肌中MYL-2 的磷酸化可引起心肌擴(kuò)張[12]，并與心肌扭曲等多種心臟疾病有關(guān)[13]。從而認(rèn)為該基因主要對(duì)心肌細(xì)胞的正常維系有重要作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，MYL-2基因在成熟的小鼠骨骼肌中表達(dá)，而在體外培養(yǎng)的C2C12 成肌細(xì)胞分化過(guò)程中不表達(dá)[14-15]。將小鼠心肌和骨骼肌中該基因敲除后，小鼠在胚胎期或初生期的生長(zhǎng)出現(xiàn)嚴(yán)重異常，甚至有致命性的表現(xiàn)[16-17]。MYL-2在小鼠II 型肌纖維完整性的維持、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞粘著、細(xì)胞遷移和分裂過(guò)程中起著重要作用[18]。因此認(rèn)為，MYL-2 可能在哺乳動(dòng)物心肌和骨骼肌的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。

顯然TNCC1和MYL-2基因在慢肌和心肌的發(fā)育中起到了關(guān)鍵作用。馬作為運(yùn)動(dòng)性較強(qiáng)的動(dòng)物，肌肉的發(fā)育尤為關(guān)鍵，尤其蒙古馬作為耐力性能較強(qiáng)的馬種,慢肌的作用顯得更為重要。但到目前為止，對(duì)以上兩種基因的研究主要集中在人和小鼠中，在家畜上的研究非常少，尤其在馬上還未見報(bào)道。

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選育，賦予了馬很多運(yùn)動(dòng)潛質(zhì)，在全球700多個(gè)馬種[19]中即有速度型馬種也有耐力型馬種。蒙古馬毋庸置疑是世界上長(zhǎng)距離連續(xù)奔跑耐力最強(qiáng)的馬種[20]，這種特質(zhì)可能是在13世紀(jì)行軍打仗、長(zhǎng)途跋涉過(guò)程中形成的。雖然具有較好的遺傳潛質(zhì)，但蒙古馬在賽前還是需要合理的訓(xùn)練才能取得優(yōu)異的成績(jī)。說(shuō)明訓(xùn)練對(duì)蒙古馬耐力的形成有重要的作用。近些年運(yùn)動(dòng)馬的研究多集中于純血馬[21]。對(duì)馬匹速度的形成和相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制已越來(lái)越清晰。但對(duì)馬匹耐力形成的分子機(jī)制知之甚少，只見在阿拉伯馬上有相關(guān)的研究[22]。尤其對(duì)蒙古馬超強(qiáng)耐力特性形成的分子機(jī)制的研究更不多見。本實(shí)驗(yàn)室前期進(jìn)行了蒙古馬高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析[23]。本試驗(yàn)試圖通過(guò)蒙古馬長(zhǎng)期高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練模擬耐力訓(xùn)練，比較運(yùn)動(dòng)前后與肌肉發(fā)育相關(guān)的基因在不同水平上的表達(dá)變化。試圖為今后馬的耐力訓(xùn)練提供科學(xué)的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試劑耗材： TRIzol試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)、SYBR Premix Ex TaqⅡ定量試劑盒(TaKaRa)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Cwbiotech公司)、兔多克隆GAPDH抗體(Abcam)、兔單克隆MYL-2抗體(Abcam)、兔多克隆TNNC1抗體(Abcam)、羊抗兔IgG-HRP(Jackson公司)、羊抗鼠IgG-HRP(Jackson公司)。

儀器設(shè)備：實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(Agilent Technologies Stratagene Mx3000P)、酶標(biāo)儀(Thermo NANODROP 2000c)、WB轉(zhuǎn)膜儀(J-MAX，ST-2)。

1.2 馬匹訓(xùn)練與肌肉樣品采集

選擇3匹5歲雌性蒙古馬作為試驗(yàn)動(dòng)物，在長(zhǎng)期高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前，將馬匹保定并注射局部麻醉劑，從臀中肌采取試驗(yàn)所需肌肉樣品(30 g)，肌肉組織離體后，迅速用蒸餾水反復(fù)沖洗并剪成黃豆顆粒大小的塊狀，立即放入液氮預(yù)冷的無(wú)RNase Ep-pendorf管中。投入液氮冷凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

待休息1周后開始為期4 個(gè)月的高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，試驗(yàn)用馬的運(yùn)動(dòng)在一個(gè)直徑為30 m，周長(zhǎng)約100 m 的圓形調(diào)教圈中進(jìn)行。為避免高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)馬造成損傷，運(yùn)動(dòng)方案將4個(gè)月按照天數(shù)分為3個(gè)階段，每階段又分為若干周期，循序漸進(jìn)地加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，讓馬慢慢適應(yīng)逐漸增強(qiáng)的負(fù)荷。

第一階段(第1～15天)：該階段持續(xù)15 d，每5 d為1個(gè)周期，起始運(yùn)動(dòng)距離為8 km，每個(gè)周期中前4 d 每日運(yùn)動(dòng)距離以2 km遞增，即第二天10 km，第三天12 km，第四天14 km，第五天休息，下一周期起始距離回到8 km，如此循環(huán)。將奔跑速度控制在20 s每圈，即大約每100 m用時(shí)20 s。此階段內(nèi)主要目的是進(jìn)行體能適應(yīng)性強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，使肌腱、韌帶和骨骼得到強(qiáng)化，幫助馬匹適應(yīng)后面高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)的壓力。

第二階段(第16～108天)：該階段持續(xù)92 d，也是高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案的主體部分。每4 d為1個(gè)周期，起始距離為15 km，每個(gè)周期中前3 d每日運(yùn)動(dòng)距離以5 km遞增，即第二天20 km，第三天25 km，第四天休息。如此循環(huán)，將速度控制在18～20 s每圈，即每100米用時(shí)18～20 s。此階段運(yùn)動(dòng)程序是為了使肌肉有氧適應(yīng)性最大化，距離逐步增加，并及時(shí)下降回歸，讓訓(xùn)練馬匹得到休息。使肌肉、心和肺等器官能夠適應(yīng)遞增的高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)。

第三階段(第109～122天)：在運(yùn)動(dòng)期最后的兩周里，要盡可能延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間和距離，運(yùn)動(dòng)起始距離為20 km，每日以10 km遞增，即第二天30 km，第三天40 km，第四天50 km，第五、六天休息，同時(shí)提高日糧中精飼料比例。將速度控制在15 s左右每圈，即每100 m用時(shí)15 s。

該階段結(jié)束后，靜養(yǎng)3 d，在清晨空腹安靜狀態(tài)下將馬匹保定，注射局部麻醉劑，從臀中肌采取試驗(yàn)所需肌肉樣品30 g，方法同“1.2”。

1.3 試驗(yàn)步驟與方法

1.3.1 RNA提取 提取每匹馬長(zhǎng)期高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后骨骼肌總RNA，步驟按常規(guī)TRIzol提取法完成。

1.3.2 將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 首先去除基因組DNA，在冰上將反應(yīng)混合液(5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，總RNA 10 μL，用RNase Free dH2O補(bǔ)至20 μL)混勻，然后42 ℃反應(yīng)2 min，4℃保存。其次進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在冰上配制反應(yīng)混合液(去除基因組DNA混合液10 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer 2 4 μL，RNase Free dH2O 4 μL)，輕柔混勻后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37 ℃反應(yīng)15 min；85℃反應(yīng)5 s；溫度降到4 ℃終止反應(yīng)，-80 ℃保存。

1.3.3 PCR引物設(shè)計(jì) 以GAPDH為內(nèi)參基因，MYL-2和TNNC1為目的基因，用Primer Premier 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，并且通過(guò)NCBI 中的Blsat功能檢測(cè)各引物的特異性。并由上海生物工程有限公司合成(引物序列見表1)。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)在Agilent Technologies Stratagene Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上完成。具體方法參照 SYBR?Rremix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)試劑盒流程進(jìn)行。擴(kuò)增體系(20 μL)：SYBR?Rremix ExTaqTMⅡ(Perfect Real Time)10 μL，PCR Forward Primer(20 μmol·L-1)0.8 μL，PCR Reverse Primer(20 μmol·L-1)0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件:反應(yīng)40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min)，最后72 ℃延伸5 min。

1.3.5 Western blot分析 首先按常規(guī)方法提取每匹馬在長(zhǎng)期高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后骨骼肌中總蛋白。采用BCA法對(duì)提取的蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。然后通過(guò)蛋白變性、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、成像及灰度分析一系列步驟對(duì)目的蛋白的表達(dá)量進(jìn)行定量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理和分析 本研究以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用2-△△Ct定量分析方法對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后蒙古馬骨骼肌中MYL-2和TNNC1基因的表達(dá)量進(jìn)行比較分析，目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct；△Ct=(運(yùn)動(dòng)前目的基因的Ct 值-運(yùn)動(dòng)前GAPDH的Ct 值)；△Ct=(運(yùn)動(dòng)后目的基因的Ct 值-運(yùn)動(dòng)后GAPDH的Ct 值)。試驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，從而減少外界以及人為操作因素對(duì)試驗(yàn)的影響。將得到的數(shù)據(jù)采用SAS9.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 蒙古馬肌肉樣品總RNA的質(zhì)量檢測(cè)

將提取的總RNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，28S 和 18S 條帶清晰，亮度較好(圖略)，表明RNA完整性較好。采用酶標(biāo)儀分別測(cè)定提取的RNA在260 nm和280 nm 光密度下的純度和濃度。檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品總RNA的OD260 nm/OD280 nm值均為1.8～2.0，說(shuō)明提取的RNA 樣品純度較好。結(jié)合檢測(cè)結(jié)果判定，提取的總RNA可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 蒙古馬肌肉樣品BCA法蛋白定量結(jié)果

提取的蒙古馬肌肉樣品的蛋白濃度為3.5～6.1 μg·μL-1，定量標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程公式為y=0.997 8x+0.121 7，R2=0.989 8(y為蛋白濃度，x為OD值，R為相關(guān)系數(shù))。標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)比較理想，預(yù)示測(cè)定的蛋白濃度數(shù)據(jù)可信，可用于后續(xù)的試驗(yàn)。

2.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后蒙古馬肌肉組織中MYL-2和TNNC1基因在mRNA水平的表達(dá)量

本試驗(yàn)以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct定量分析法對(duì)MYL-2和TNNC1基因在長(zhǎng)期高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后蒙古馬骨骼肌中的表達(dá)量進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)長(zhǎng)期高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后蒙古馬骨骼肌中MYL-2和TNNC1基因的表達(dá)量極顯著高于訓(xùn)練前(P<0.01)。說(shuō)明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)該基因的表達(dá)量有明顯的促進(jìn)作用，從而對(duì)蒙古馬的運(yùn)動(dòng)性能產(chǎn)生影響，結(jié)果如圖2所示。

**表示差異極顯著(P<0.01)。圖3同** represent the extremely significant difference(P<0.01).The same as Figure3圖2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后蒙古馬骨骼肌中MYL-2和TNNC1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression quantity of MYL-2 and TNNC1 genes in Mongolian horses skeletal muscle before and after high loading exercise

2.4 蒙古馬高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后MYL-2和TNNC1基因在翻譯水平的表達(dá)

本試驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參，采用Western blot技術(shù)對(duì)蒙古馬高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后骨骼肌中MYL-2和TNNC1基因在翻譯水平的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。圖3a顯示，在蒙古馬長(zhǎng)期高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后的肌肉組織中MYL-2和TNNC1蛋白均有表達(dá)，但在高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后表達(dá)水平不同。使用Gel Image ststem ver.4.00 軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析，結(jié)果顯示(圖3b)，MYL-2和TNNC1蛋白在高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后在蛋白水平的表達(dá)量均高于高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前，且MYL-2蛋白在高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后的蛋白表達(dá)量較高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前有了極顯著的增加(P<0.01)，而TNNC1蛋白在高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后蛋白表達(dá)量的增加相比高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前并未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

a.Western blot檢測(cè)MYL-2 和TNNC1的蛋白表達(dá)：1前和1后為一號(hào)馬運(yùn)動(dòng)前后肌肉樣品；2前和2后為二號(hào)馬運(yùn)動(dòng)前后肌肉樣品；3前和3后為三號(hào)馬運(yùn)動(dòng)前后肌肉樣品。b.MYL-2 和TNNC1蛋白表達(dá)的灰度分析a.The expression of MYL-2 and TNNC1 proteins detected by Western blot: The number represent the sample number before and after exercise. b.The gray value analysis of MYL-2 and TNNC1 proteins expression圖3 蒙古馬高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后骨骼肌中MYL-2 和TNNC1的蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of MYL-2 and TNNC1 proteins in skeletal muscle before and after high loading exercise in Mongolia horses

3 討 論

本試驗(yàn)首先對(duì)蒙古馬長(zhǎng)期高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)前后肌肉發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異性分析。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后蒙古馬肌肉組織中TNNC1和MYL-2基因的表達(dá)量發(fā)生上調(diào)，極顯著高于高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)前(P<0.01)。其次，為了進(jìn)一步研究高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)蒙古馬肌肉發(fā)育相關(guān)基因在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)是否一致，采用免疫印跡方法對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，在高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后MYL-2和TNNC1在蛋白水平的表達(dá)量均高于高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)前，且MYL-2在高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后的表達(dá)量較高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)前有了明顯的上調(diào)，差異極顯著(P<0.01)，這與本試驗(yàn)的熒光定量結(jié)果完全一致。而TNNC1在高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后蛋白表達(dá)量相比高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)前也有一定的上調(diào)趨勢(shì)，但未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，這與本試驗(yàn)熒光定量的結(jié)果趨勢(shì)一樣。

在其他研究中，通過(guò)對(duì)100頭豬肉樣品及肉質(zhì)性狀的數(shù)據(jù)處理，發(fā)現(xiàn)基因TNNC1與豬肉的肉質(zhì)性狀密切相關(guān)。隨后進(jìn)一步驗(yàn)證了TNNC1基因在豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)TNNC1基因的表達(dá)量與滴水損失、pH24 h、肉色等肉質(zhì)性狀相關(guān)[24]。對(duì)山羊的TNNC1基因研究發(fā)現(xiàn)，該基因在非肌肉組織中，如肝和腦，其表達(dá)量很低，甚至沒(méi)有表達(dá)。因而，無(wú)論是在非肌肉組織中沒(méi)有表達(dá)或是表達(dá)量極低，都印證TNNC1基因表達(dá)的獨(dú)特性，即在心中和慢肌纖維含量高的肌肉中高表達(dá)，而在其他組織中都是低表達(dá)甚至是不表達(dá)。此外，TNNC1及MyHC基因以及肌纖維類型之間存在著緊密的共表達(dá)規(guī)律[25]。研究證明，體外培養(yǎng)成肌細(xì)胞時(shí)，在成肌細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng)的時(shí)候，綠頭鴨TNNC1基因的表達(dá)量相對(duì)減少，而在肌纖維形成和成熟時(shí)，該基因的表達(dá)量較高[26]。在細(xì)胞增長(zhǎng)的快速階段主要是Desmin基因表達(dá)，但在營(yíng)養(yǎng)耗盡，或是說(shuō)在細(xì)胞增長(zhǎng)的平臺(tái)期，主要表達(dá)Mckand和TNNC1基因。因而TNNC1基因與肌肉生長(zhǎng)有一定的關(guān)系[27-28]。趙啟南等[29]通過(guò)對(duì)訓(xùn)練前后蒙古馬肌肉轉(zhuǎn)錄組的測(cè)定也發(fā)現(xiàn)，TNNC1基因?yàn)楦弑磉_(dá)基因。熒光定量PCR分析表明，天府肉羊TNNC1基因在心肌、慢骨骼肌(比目魚肌)高表達(dá)，極顯著高于在快肌骨骼肌和其他內(nèi)臟組織中的表達(dá)[30]。研究顯示，TnC與TnT、TnI結(jié)合成肌鈣蛋白復(fù)合物(Tn),肌鈣蛋白復(fù)合物 (Tn) 再與原肌球蛋白(Tm) 一起構(gòu)成 Tm-Tn 復(fù)合體，調(diào)節(jié)肌肉收縮與舒張的力量和速度。Tm-Tn 復(fù)合體位于橫紋肌的細(xì)肌絲和心肌細(xì)胞的細(xì)肌絲上。Tm-Tn 復(fù)合體對(duì)肌肉收縮的調(diào)節(jié)作用需要在Ca2 +的誘導(dǎo)下進(jìn)行。鈣從肌質(zhì)網(wǎng) (sarcoplasmic reticulum) 釋放出來(lái)，與肌鈣蛋白結(jié)合而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，于是被抑制的肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白相互作用，致使肌肉發(fā)生收縮。如果鈣被去除，肌鈣蛋白恢復(fù)原來(lái)狀態(tài)，肌肉便發(fā)生松弛，這就是肌肉收縮的一個(gè)循環(huán)過(guò)程[14, 31-36]。

而本研究發(fā)現(xiàn)，在蒙古馬長(zhǎng)期高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)前后的臀中肌中TNNC1基因均有所表達(dá)。并且通過(guò)為期4個(gè)月的高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后表達(dá)量明顯提高，呈現(xiàn)了極顯著差異(P<0.01)。由此可推斷，通過(guò)高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可能促進(jìn)了蒙古馬肌肉的有效發(fā)育，甚至改變了快肌和慢肌的比例，從而有效提高蒙古馬骨骼肌中TNNC1基因的表達(dá)量。TNNC1基因雖在蒙古馬高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)前后mRNA水平上有顯著差異，但在蛋白水平上的結(jié)果為差異不顯著(P>0.05)，總結(jié)原因?yàn)閮煞矫妫阂环矫婵赡芘c蛋白表達(dá)的延滯性有關(guān)；另一方面，基因的表達(dá)是DNA-RNA-蛋白，期間有轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控以及翻譯后調(diào)控等多種調(diào)控機(jī)制影響著該基因的表達(dá)，也有可能在mRNA到蛋白的翻譯過(guò)程中由于非編碼RNA等的相應(yīng)調(diào)控作用導(dǎo)致在蛋白水平上的表達(dá)不顯著。

吳華俊等[37]的研究結(jié)果顯示，在松墨天牛成蟲身體的各個(gè)部位中MYL-2表達(dá)量不盡相同，其中松墨天牛成蟲足部MYL-2的表達(dá)量最高，這是由于足部是動(dòng)物運(yùn)動(dòng)的主要器官，因此足部富含肌肉蛋白。頭部、觸角和胸部MYL-2的表達(dá)量次之，這與動(dòng)物在覓食和求偶等活動(dòng)中離不開運(yùn)動(dòng)有密切相關(guān)。而在腹部MYL-2的表達(dá)量極低，這正是因?yàn)楦共繛樗赡炫３上x的整體部分，不參與運(yùn)動(dòng)功能，因此MYL-2表達(dá)量低。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，MYL-2 可能在肌肉肥大過(guò)程中執(zhí)行作用。經(jīng)檢測(cè)，MYL-2 在成熟肌肉中表達(dá)，而在培養(yǎng)的鼠 C2C12成肌細(xì)胞分化過(guò)程中不表達(dá)[38-39]。在鼠非肌肉成纖維細(xì)胞中，MYL-2 對(duì) II 型肌纖維完整性的維持起著重要的作用，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞粘著、遷移和分裂起著關(guān)鍵的作用[18]。說(shuō)明MYL-2對(duì) II 型肌纖維的活性有調(diào)節(jié)作用。同樣地，將小鼠的心肌和骨骼肌中該基因敲除后，發(fā)現(xiàn)小鼠在胚胎期或初生期出現(xiàn)嚴(yán)重的反常，甚至有致命性的表現(xiàn)[14]。

本試驗(yàn)中，長(zhǎng)期高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后蒙古馬臀中肌中MYL-2基因及其蛋白水平的表達(dá)都有顯著的提高，這與先前的研究基本一致，運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)的肌肉中該基因表達(dá)量明顯增高。因此，高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)能夠有效提高蒙古馬肌肉組織中MYL-2基因的表達(dá)量，從而促進(jìn)肌肉的發(fā)育，提高其耐力性能。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，MYL-2和TNNC1基因與蒙古馬的耐力性能存在著密切的關(guān)系，更全面地了解到先前篩選的與肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育相關(guān)的基因在蒙古馬長(zhǎng)期高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)前后的變化及調(diào)控。為下一步對(duì)蒙古馬進(jìn)行系統(tǒng)的訓(xùn)練和探討耐力基因的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。