郝 飛，毛 立，李文良*，李基棕，楊蕾蕾，張紋紋，孫 敏，鐘純燕,2，劉茂軍，江杰元*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程重點實驗室，南京 210014； 2.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025)

山羊皰疹病毒Ⅰ型(caprine herpesvirus 1，CpHV-1)是皰疹病毒科皰疹病毒甲亞科水痘病毒屬的雙鏈DNA病毒[1-2]。該病毒感染成年山羊后表現(xiàn)為亞臨床感染，可導致產(chǎn)生不同的癥狀，包括呼吸系統(tǒng)疾病、發(fā)熱和白細胞減少，外陰陰道炎和包皮龜頭炎[3]。懷孕3至4個月的山羊感染后可誘發(fā)流產(chǎn)。新生羔羊表現(xiàn)嚴重感染，主要癥狀為發(fā)熱、結膜炎、眼分泌物增多、呼吸困難、腸道潰瘍性和壞死性病變，并伴隨著較高的發(fā)病率和死亡率[4]。1974年，CpHV-1首先在美國加利福尼亞表現(xiàn)為腸炎的新生羔羊病料中分離到[5]，此后相繼在歐洲、大洋洲和南美洲出現(xiàn)該病毒的流行[6-9]。此前我國一直沒有該病報道。

2013年至2014年，江蘇多地山羊養(yǎng)殖場育肥山羊陸續(xù)出現(xiàn)以呼吸道癥狀為主的疾病，發(fā)病率與死亡率較高，藥物治療效果較差。病羊主要表現(xiàn)為精神沉郁、流漿液或膿性鼻液、逐漸消瘦，剖檢可見肺部出現(xiàn)不同程度病變。通過實際調查、多次采樣，對樣品中可能的相關病原進行了檢測，在多數(shù)樣品中檢出山羊副流感病毒3型(CPIV3)[10]，同時還檢出了一種未知DNA病毒，通過對陽性樣品進行病毒分離鑒定、純化，獲得一株CpHV-1中國分離株，將其命名為JSHA1405。采用山羊人工感染試驗研究該病毒在本屬動物體內的復制、排毒、臨床癥狀等情況，以期為規(guī)?；B(yǎng)羊呼吸道疫病的病原學研究以及該病的防控技術研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料與試劑

病料為2014年采自江蘇某山羊養(yǎng)殖場具有呼吸道癥狀的鼻拭子樣本(共12份)，-80 ℃保存；牛腎傳代細胞(MDBK)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。病毒核酸提取試劑盒、膠回收試劑盒購自Axygen公司；DH5α感受態(tài)細胞、LATaq酶、pMD18-T載體購自TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 PCR檢測

按試劑盒說明書提取鼻拭子總DNA，PCR擴增CpHV-1gB基因，PCR總體積20 μL，其中2×GC Buffer 10 μL，dNTP 2 μL，LATaq酶0.2 μL，上下游引物各1 μL(F：5′-TCGAAGGCCGAGTACCTGCG-3′，R：5′-CCAGTCCCAGGCCACGGTCAC-3′)，DNA模板2 μL。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應結束后取PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并拍照記錄。

1.3 病毒的分離與純化

將鼻拭子樣本經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，接種于MDBK單層細胞培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞病變(CPE)。無CPE則于4 d收毒，繼續(xù)盲傳直至出現(xiàn)穩(wěn)定的CPE。按參考文獻[11]中的方法進行病毒蝕斑純化，經(jīng)三輪純化后將最后一次挑取的蝕斑接種于MDBK細胞上擴大培養(yǎng)，經(jīng)鑒定后作為第一代純化病毒。

1.4 病毒粒子的形態(tài)學鑒定

收獲感染第4代病毒的MDBK細胞培養(yǎng)物200 mL，12 000 r·min-1離心30 min去除細胞碎片，上清經(jīng)40 000 r·min-1超速離心2 h，沉淀用PBS溶解過夜。加樣于銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸負染后，透射電子顯微鏡(Tecnai 12，PHILIPS)下觀察病毒粒子形態(tài)。

1.5 gB基因克隆及進化分析

根據(jù)GenBank不同毒株基因序列設計引物分兩段擴增完整的CpHV-1gB基因：F1 5′-GTGCCCCAGCGGCGTCTACCTAA-3′，R1 5′-CGCCAGGTACGTGTCCGTCTTCCC-3′；F2 5′-CGGGACGAA-AGTCGCGGAAAC-3′；R2 5′-TCATGCCCCCCCGA-CGTC-3′。PCR體系總體積20 μL，其中2×GC Buffer 10 μL，dNTP 2 μL，LATaq酶0.2 μL，上、下游引物各1 μL,DNA模板2 μL。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，52 ℃(F1、R1)/48 ℃(F2、R2) 1 min，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物純化后克隆至pMD18-T載體，陽性質粒送南京擎科生物科技有限公司進行測序。測序結果與GenBank上其他反芻動物α-皰疹病毒毒株的gB基因序列進行比對，用MEGA5.1軟件采用Neighbor-joining(NJ)方法構建系統(tǒng)進化樹，分析分離株與其他毒株的進化關系。

1.6 人工感染試驗

將純化后第4代病毒液(TCID50為 10-6.5·100 μL-1)以肌內注射3 mL的方式感染陰性山羊5只，另設5只 作為陰性對照組，按相同劑量和方法接種MDBK細胞培養(yǎng)上清。攻毒后兩組分圈飼養(yǎng)，觀察35 d，每天定時測定直腸溫度，觀察并記錄各組山羊的臨床癥狀。攻毒后第1、3、5、7、9、12、14、16、19、21、28、35天采集各組山羊的鼻拭子、肛拭子及血清樣品。采用“1.2”中的方法檢測鼻拭子、肛拭子排毒情況，并按“1.3”中方法將陽性樣品在MDBK細胞上進行病毒分離。按照參考文獻[12]中的方法進行血清中和抗體檢測。

2 結 果

2.1 PCR檢測與病毒分離

共采集12份鼻拭子樣品，PCR檢測到9份陽性。將陽性病料接種MDBK細胞后，盲傳至第3代時，在接毒后24～48 h產(chǎn)生明顯CPE。傳至第5代后可出現(xiàn)穩(wěn)定的CPE。接毒后24 h可見細胞腫脹，失去光澤，部分細胞出現(xiàn)折光性增強，變圓變亮；接毒后36 h，部分細胞發(fā)生脫落，死亡(圖1B)；接毒后48 h 80%細胞發(fā)生脫落。

2.2 分離毒株的形態(tài)學及核酸鑒定

電鏡觀察超離純化后的病毒，可見直徑約100 nm 球狀有囊膜的病毒顆粒(圖1C)，符合反芻動物α-皰疹病毒的一般形態(tài)特征。

擴增分離毒株gB基因完整閱讀框序列，測序得到2 763 bp的編碼序列，將此gB基因序列與GenBank上山羊皰疹病毒Ⅰ型(CpHV-1)、牛皰疹病毒Ⅰ型不同基因型毒株(BoHV-1、BoHV-1.1、BoHV-1.2、BoHV-5、BuHV-1)及鹿皰疹病毒1型(CvHV-1)的相應基因序列進行相似性對比分析。結果表明：分離毒株JSHA1405gB基因與CpHV-1 E/CH株gB基因相似性最高，為99.2%；與BoHV-1 Salla82株相似性最低，為84.7%。進化分析結果表明JSHA1405株與CpHV-1 E/CH株同屬一個分支，屬于山羊皰疹病毒Ⅰ型，系統(tǒng)進化樹如圖2所示。

綜上判定，分離毒株JSHA1405為山羊皰疹病毒Ⅰ型。

A.正常MDBK細胞(36 h)；B.接毒后36 h細胞；C.電子顯微鏡下病毒粒子形態(tài)A. Normal MDBK cells for 36 hours; B. The MDBK cells inoculated virus for 36 hours; C. Virion observed by TEM圖1 細胞及病毒粒子形態(tài)學觀察Fig.1 Cells and virion morphology observation

2.3 人工感染試驗

攻毒組山羊(CC)在感染病毒后第1天開始出現(xiàn)體溫升高(>40 ℃)，發(fā)熱過程最長可持續(xù)至攻毒后10 d(圖3)，體溫最高可達41.8 ℃。感染病毒后第3天攻毒組山羊開始出現(xiàn)呼吸道癥狀并持續(xù)到第12天，羊群表現(xiàn)為精神沉郁、流漿液性或膿性鼻涕(表1)。此外，攻毒組山羊可以通過鼻腔和糞便排毒，感染后3 d可在鼻拭子和肛拭子中檢測到病毒，排毒可持續(xù)6 d左右(表1)。將檢測為陽性的條帶回收后測序，結果顯示擴增毒株為CpHV-1。陽性樣品接種MDBK細胞能產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞病變，PCR檢測為CpHV-1。對照組山羊(NC)表現(xiàn)正常且未檢出排毒(圖3、表1)。中和試驗結果顯示，山羊在攻毒后第7天出現(xiàn)中和抗體，第28天達到最高峰，抗體效價最高可達1 024；對照組山羊未檢測到中和抗體(表1)。

▲. 本試驗分離毒株▲. Isolated strain圖2 反芻動物皰疹病毒gB基因核苷酸系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree inferred by nucleotide sequences from the gB regions of ruminant alphaherpesviruses

圖3 羊群體溫變化圖Fig.3 Rectal temperature measurement in goats

3 討 論

近年來，中國肉羊養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展，規(guī)?；犸曇殉蔀槲覈庋虍a(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要模式之一。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，飼養(yǎng)密度的增加，疾病防控面臨著越來越大的壓力。呼吸道疾病是危害養(yǎng)羊業(yè)尤其是圈舍養(yǎng)羊的重要疫病之一[13]，目前對相關致病病原的研究主要集中在小反芻獸疫病毒、支原體、山羊副流感病毒3型以及巴氏桿菌等方面[10,14-18]。山羊皰疹病毒Ⅰ型(CpHV-1)可引起羔羊出現(xiàn)致命全身性感染以及成年山羊亞臨床呼吸道和生殖系統(tǒng)感染[3-4]，該病于1974年首次在美國出現(xiàn)，5年后在瑞士也發(fā)現(xiàn)該病毒感染。雖然對該病毒的全球流行分布情況尚未進行系統(tǒng)研究，但是歐洲、澳大利亞、新西蘭、加拿大和巴西已陸續(xù)報道該病毒感染的存在。本病在地中海沿岸國家分布比較廣泛，在這些國家檢測到了較高的抗體陽性率(希臘超過50%，西班牙為21%，意大利南部為60%)，最新研究報道在法國本土南部地區(qū)也出現(xiàn)該病毒感染[9,19]。我國此前沒有該病的報道，也沒有對其進行相關調查。

表1 各組山羊臨床癥狀、排毒情況和中和抗體滴度檢測結果

a. 采樣時間，數(shù)字是幾就是指第幾天所采樣品；-.正常；+.輕度；++.中度

a. Sampling time, the number refers to the sample taken on that day. -. Normal; +. Mild; ++. Moderate

國外研究表明，高養(yǎng)殖密度、快速育肥的養(yǎng)殖模式以及與其他病毒共感染是引起CpHV-1感染的幾大風險因素[19]。本研究采集具有呼吸道癥狀的育肥羊鼻拭子樣本，經(jīng)病原學檢測發(fā)現(xiàn)存在CpHV-1感染，同時也檢測到了CPIV3和綿羊肺炎支原體感染存在。該結果與國外研究相佐證，同時也提示導致2013—2014年江蘇多地規(guī)?；犸暱焖儆恃蛉寒a(chǎn)生嚴重呼吸道癥狀的病原是多樣的，在高養(yǎng)殖密度壓力下，一旦感染某種病原，其他病原可趁機導致繼發(fā)感染，共同作用，導致發(fā)病羊群臨床癥狀表現(xiàn)較以往嚴重，藥物治愈率低下。

對此次成功分離的CpHV-1中國分離株JSHA1405的致病性進行了研究，結果表明：JSHA1405分離株可導致山羊急性發(fā)熱，并持續(xù)一周以上，這與國外的研究結果[20]一致。攻毒組山羊在攻毒后出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀，且可通過鼻腔/糞便排毒。與國外研究相比，本研究第一次發(fā)現(xiàn)可以從肛拭子中檢測到排毒。攻毒組山羊在攻毒后能夠產(chǎn)生中和抗體，抗體效價最高可達1 024，而國外類似的研究中攻毒組山羊的中和抗體效價最高為64[20]，這可能與不同毒株間毒力差異有關(國外研究中的研究對象為從潛伏感染山羊中分離到的毒株)。

這是首次檢測到CpHV-1在我國的存在，隨后本實驗室又分別于2014年和2015年從省內另外兩個山羊養(yǎng)殖場的育肥羊群檢測到該病原的存在并分離到病毒(NJ1401和HA1501)，gB基因相似性大于99%(數(shù)據(jù)略)。這表明該病毒在國內羊群中具有一定的流行率?；诖耍緢F隊先后建立了熒光定量PCR檢測方法和ELISA檢測方法，正在對不同年齡段、不同性別羊群中CpHV-1的流行分布情況進行系統(tǒng)研究。

4 結 論

首次從國內具有呼吸道癥狀的發(fā)病羊中分離并鑒定山羊皰疹病毒Ⅰ型，經(jīng)對其gB基因測序，病毒形態(tài)學鑒定和致病性試驗證實分離到病毒，命名為JSHA1405。該研究為進一步預防和控制山羊皰疹病毒Ⅰ型感染的發(fā)生和流行提供了基礎。