王成斌，王小鵬，鄭小明，陳 浩，張俊杰，郭源梅，丁能水*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045；2.國(guó)家級(jí)玉江豬(玉山黑豬)保種場(chǎng)，玉山 334700)

豬是繼狗和羊之后第三個(gè)被人類馴養(yǎng)的家畜[1]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的人工選擇和自然選擇，家豬形成了豐富的品種和多樣化的體型外貌特征。玉山黑豬是江西省第一個(gè)被列入國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄的地方豬種，具有早熟易肥，肉質(zhì)細(xì)嫩、鮮美等特點(diǎn)，其全身被毛黑色。玉山黑豬的頭型有兩類：“獅子頭”型和“馬臉”型?！蔼{子頭”型頭大，額寬，且有較深的皺紋；嘴筒短略上翹，軀干背腰不平；腹下垂，體短，體型較小，體質(zhì)較疏松。“馬臉”型頭中等大，軀干背腰平直，體長(zhǎng)[2]。迄今為止，導(dǎo)致這兩種頭型的遺傳機(jī)制尚未被解析。深入揭示玉山黑豬不同頭型的形成機(jī)制對(duì)玉山黑豬種質(zhì)特性形成機(jī)理研究、品種多樣性的保護(hù)及利用具有重要的指導(dǎo)意義。

在人工選擇的過(guò)程中，對(duì)目標(biāo)基因的定向選擇會(huì)導(dǎo)致種群的某一性狀發(fā)生改變。目的基因優(yōu)勢(shì)等位基因頻率在選擇的作用下會(huì)不斷提高，其附近與之緊密連鎖的等位基因頻率將伴隨其一同升高，此現(xiàn)象稱為選擇性清除(selective sweep)。因此，受到選擇的基因組區(qū)域會(huì)表現(xiàn)出選擇性清除信號(hào)，如連鎖不平衡值(linkage disequilibrium, LD)升高、核苷酸多態(tài)性(DNA polymorphism)下降等[3]。選擇和遺傳漂變都能導(dǎo)致遺傳分化和選擇信號(hào)的產(chǎn)生，表現(xiàn)為不同種群間等位基因頻率差異顯著。遺傳分化系數(shù)(Fst)是檢測(cè)群體遺傳分化程度的重要指標(biāo)，由Wright[4]

提出，用于計(jì)算物種亞群之間的分化程度。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)自2005年首次報(bào)道應(yīng)用于人視網(wǎng)膜黃斑變性遺傳機(jī)理研究以來(lái)，其在人類復(fù)雜疾病研究領(lǐng)域取得了迅速發(fā)展。研究人員通過(guò)GWAS發(fā)現(xiàn)了大量與疾病相關(guān)聯(lián)的遺傳變異。在家豬中，自2011年第一篇應(yīng)用GWAS研究豬毛色的文章報(bào)道以來(lái)[5]，GWAS在家豬重要經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)基因的鑒別中同樣得到了廣泛應(yīng)用[6-7]。

本研究嘗試?yán)秘i全基因組60K SNP芯片數(shù)據(jù)，檢測(cè)玉山黑豬“獅子頭”和“馬臉”兩種頭型種群間的遺傳分化信號(hào)，并進(jìn)行病例-對(duì)照的全基因組關(guān)聯(lián)分析，初步篩選與頭型相關(guān)的染色體關(guān)聯(lián)區(qū)域，并在這些區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)令人感興趣的候選基因，以期初步解析玉山黑豬形成不同頭型的分子機(jī)制，為深入研究玉山黑豬及中國(guó)地方豬種群體內(nèi)不同頭型的形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及表型測(cè)定

本研究選取國(guó)家級(jí)玉山黑豬保種場(chǎng)的36頭原種豬，其中“獅子頭”型豬12頭，“馬臉”型豬24頭(圖1)。在出生時(shí)測(cè)定初生重，斷奶時(shí)測(cè)定斷奶重，豬只180日齡時(shí)，測(cè)定其體重、體長(zhǎng)、體高、背高、胸圍、胸深、腹圍、管圍、腿臀圍，并做好記錄。

a.馬臉型；b.獅子頭型a. Long-pointed head; b. Short head圖1 玉山黑豬不同頭型個(gè)體Fig.1 Different head types in Yushan Black pigs

1.2 DNA提取、60K SNP判型及質(zhì)控

采集耳組織樣品，按常規(guī)的酚/氯仿法提取耳組織DNA，將其溶于TE緩沖液中，并統(tǒng)一稀釋至50 ng·μL-1，用ILLumina豬60K SNP芯片進(jìn)行掃描分型。芯片分型工作委托北京怡美通德公司按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程完成。用Plink軟件(Plink v1.07)對(duì)SNP進(jìn)行質(zhì)控，剔除個(gè)體檢出率<90%、最小等位基因頻率<0.05、極顯著偏離哈代溫伯格平衡(P<0.000 001)、染色體位置不確定的SNP位點(diǎn)和剔除SNP檢出率<90%的個(gè)體，最后剩余26 480個(gè)SNPs用于后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 玉山黑豬兩種頭型間表型差異性分析 用R語(yǔ)言(R v3.3.1)中的aov()函數(shù)對(duì)所記錄的11個(gè)性狀進(jìn)行組間方差分析[9]。將性別、批次(年、季)和180日齡體重作為協(xié)變量，比較這些表型性狀在“獅子頭”型和“馬臉”型兩組間是否存在顯著差異。

1.3.2 玉山黑豬兩種頭型間遺傳分化系數(shù)(Fst)的計(jì)算 用R語(yǔ)言(R v3.3.1)中的Genepop軟件包計(jì)算“獅子頭”型和“馬臉”型兩類群體之間每個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳分化系數(shù)(Fst)值：

其中，MSG為群體內(nèi)的觀測(cè)均方差：

MSP為群體間的觀測(cè)均方差：

nc是指校正后群體間的平均樣本大?。?/p>

1.3.3 玉山黑豬兩種頭型的全基因組關(guān)聯(lián)分析 采用病例-對(duì)照的全基因組關(guān)聯(lián)分析，應(yīng)用GEMMA(genome-wide efficient mixed-model association)軟件[11]中的單變量線性混合模型(univariate linear mixed model)來(lái)比較全基因組上“獅子頭”型個(gè)體和“馬臉”型個(gè)體間等位基因及基因型頻率的差異，搜尋與目標(biāo)性狀基因座處于連鎖不平衡的位點(diǎn)。為了消除群體分層對(duì)GWAS結(jié)果的影響，GEMMA將提前生成的一個(gè)分子親緣關(guān)系矩陣作為隨機(jī)效應(yīng)帶入到模型中：

y=Wα+xβ+u+ε

式中，y為所有個(gè)體的表型值向量；W為協(xié)變量矩陣；α為包含截距的相應(yīng)的系數(shù)向量；x為SNP的基因型向量；β為SNP的影響效應(yīng)；u為隨機(jī)效應(yīng)向量；ε為誤差向量。將表型對(duì)性別和批次(年、季)進(jìn)行回歸分析，并用殘差作為新的表型用于上述分析[12]。

采用Bonferroni方法確定關(guān)聯(lián)顯著性閾值，基因組顯著水平閾值為0.05/N，N為有效SNP個(gè)數(shù)，即0.05/26 480=1.89E-06。通過(guò)與最高點(diǎn)SNP連鎖不平衡(LD)r2≥0.8的SNP位點(diǎn)確定置信區(qū)間。使用Haploview程序[13]生成單倍型及單倍型框。采用QQ-plot通過(guò)比較無(wú)效假設(shè)的分布與實(shí)際關(guān)聯(lián)性分布的差異來(lái)檢測(cè)是否具有群體層化效應(yīng)。

1.3.4 玉山黑豬兩種頭型候選基因的鑒別參照SusscrofaBuild 10.2基因組注釋版本(http://www.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index)，查找遺傳分化顯著區(qū)域和GWAS置信區(qū)間內(nèi)的基因。利用GeneCards (http://www.genecards.org/) 數(shù)據(jù)庫(kù)查找這些基因的生物學(xué)功能。為避免遺漏基因，針對(duì)家豬基因組中尚未注釋的RefSeq基因，利用UCSC Genome Browser 數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//genome.ucsc.edu/)選出在人和小鼠中注釋的同源基因。

2 結(jié) 果

2.1 玉山黑豬兩種頭型群體間表型差異分析

本研究統(tǒng)計(jì)分析了玉山黑豬“獅子頭”型和“馬臉”型兩個(gè)類群的11個(gè)表型性狀(表1)，發(fā)現(xiàn)“馬臉”型豬比“獅子頭”型豬的體長(zhǎng)要長(zhǎng)，體型要大，但差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05)?！榜R臉”型豬的管圍顯著大于“獅子頭”型豬(P<0.05)。

2.2 玉山黑豬兩種頭型群體間遺傳分化信號(hào)的檢測(cè)

玉山黑豬兩種頭型的群體間總體上不存在明顯的遺傳分化，所得Fst值平均值為0.031(圖2)。Fst值最高的10個(gè)SNP涉及11個(gè)基因(表2)。遺傳分化最顯著的選擇信號(hào)位于10號(hào)染色體上，F(xiàn)st值最大的SNP位點(diǎn)CASI0009931位于SSC10的11.36 Mb處(圖3a)。

藍(lán)線代表Fst的平均值The blue line indicates the average Fst value圖2 所有SNP位點(diǎn)遺傳分化系數(shù)(Fst)值的密度分布Fig.2 Distribution of genetic differentiation coefficient (Fst) values of all the SNPs

a.全基因組SNP的Fst值分布圖；b. GWAS曼哈頓圖：圖中虛線代表5%基因組顯著水平閾值a. Distribution of Fst values of all qualified SNPs across the genome; b. Manhattan plot of GWAS: The dashed lines indicate the 5% genome-wide significant threshold values圖3 全基因組Fst值分布圖和GWAS曼哈頓圖Fig.3 The distribution of Fst values of SNPs across the genome and Manhattan plot of GWAS

2.3 玉山黑豬兩種頭型的全基因組關(guān)聯(lián)分析

通過(guò)GEMMA軟件對(duì)所有個(gè)體進(jìn)行病例-對(duì)照的全基因組關(guān)聯(lián)分析，并經(jīng)Q-Q plot檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，膨脹系數(shù)(λ)為1.037,表示沒(méi)有明顯的群體層化效應(yīng)(圖4)。我們?cè)赟SC10上檢測(cè)到了2個(gè)基因組顯著水平的SNPs，最高點(diǎn)SNP(ALGA0056978，P=5.38E-07)位于11.76 Mb處(圖3b)，與Fst最高值的SNP(CASI0009931,SSC10:11.36 Mb)相距僅400 kb。通過(guò)與最高點(diǎn)連鎖不平衡(LD)r2≥0.8及單倍型分析,確定該位點(diǎn)的置信區(qū)間為11.76～12.05 Mb(圖5)。

橫坐標(biāo)為預(yù)期P值對(duì)數(shù)的相反數(shù)(將負(fù)數(shù)轉(zhuǎn)換為正數(shù))，縱坐標(biāo)為計(jì)算P值對(duì)數(shù)的相反數(shù)X axis means the expected values of the opposite of exponential P values, the Y axis means the observed values of the opposite of exponential P values圖4 Quantile-quantile (QQ) 圖Fig.4 Quantile-quantile (QQ) plot

3 討 論

近年來(lái)，中國(guó)地方豬因其優(yōu)異的種質(zhì)特性受到研究者的廣泛關(guān)注，為科研工作在繁殖性狀、肉質(zhì)性狀和遺傳進(jìn)化等領(lǐng)域提供了重要的研究材料[14]。在《中國(guó)畜禽遺傳資源志·豬志》收錄的豬種中，有18個(gè)豬種(東串豬、山豬、岔路黑豬、金華豬、仙居花豬、皖南黑豬、濱湖黑豬、杭豬、樂(lè)平豬、玉江豬、大蒲蓮豬、確山黑豬、陽(yáng)新豬、大圍子豬、通城豬、德保豬、文昌豬、漢江黑豬)存在頭型的分離。從其中心產(chǎn)區(qū)的分布地域來(lái)看，這些具有頭型變異的豬種主要集中在長(zhǎng)江中下游流域。不同頭型的產(chǎn)生可能與長(zhǎng)江中下游流域祭祀習(xí)俗有關(guān)。清吳谷人《新年雜詠》中寫到“杭俗，歲終禮神尚豬首，至年外猶足充饌。定買豬頭在冬至前，選皺紋如‘壽’字者，謂之‘壽頭豬頭’?！薄蔼{子頭”型豬符合了當(dāng)時(shí)社會(huì)活動(dòng)和人們祭祀的文化需求而受到了選擇。

我們對(duì)玉山黑豬兩種頭型的群體進(jìn)行了遺傳分化信號(hào)檢測(cè)，Wright[4]建議，F(xiàn)st為0～0.05表明群體間遺傳分化程度較小，可以忽略，F(xiàn)st為0.05～0.15表明群體間分化程度為中等，F(xiàn)st為0.15～0.25表明群體間分化程度較大，F(xiàn)st大于0.25則表明群體間分化程度很大。本研究所得到的Fst平均值為0.031(圖2)，說(shuō)明玉山黑豬兩種頭型的群體間總體上不存在明顯的遺傳分化。我們對(duì)玉山黑豬“獅子頭”型和“馬臉”型兩個(gè)類群的11個(gè)表型性狀進(jìn)行了差異性分析，結(jié)果表明大部分性狀(除管圍外)均差異不顯著。這些結(jié)果符合了玉山黑豬品種選育的實(shí)踐-即無(wú)論是“獅子頭”型還是“馬臉”型都是按照相同的方向進(jìn)行選育的，玉山黑豬并沒(méi)有形成兩種特定的、存在明顯遺傳分化和表型巨大差異的亞群。這為后續(xù)基于“病例-對(duì)照”的兩種頭型群體的全基因組關(guān)聯(lián)分析奠定了基礎(chǔ)。將僅存在頭型差異的兩組玉山黑豬群體進(jìn)行了基于“病例-對(duì)照”的全基因組關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，在10號(hào)染色體上檢測(cè)到了與遺傳分化信號(hào)相互重合的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。通過(guò)連鎖不平衡(LD)和單倍型分析，將置信區(qū)間定位在11.76～12.05 Mb(圖5)。此區(qū)間內(nèi)包含兩個(gè)可能的候選基因：RAB3GAP2和IARS2。

RAB3GAP2(RAB3-GTP酶激活蛋白催化亞單位2)編碼的蛋白質(zhì)屬于RAB3蛋白質(zhì)家族，參與調(diào)節(jié)胞外分泌的神經(jīng)遞質(zhì)和激素，可能參與神經(jīng)發(fā)育過(guò)程如增殖、遷移和分化前突觸的形成[15]。在人中，與RAB3GAP2相關(guān)的疾病有Martsolf綜合征和Warburg Micro綜合征，其癥狀表現(xiàn)為顱面部骨骼發(fā)育異常(顴骨扁平、高顎)和智力障礙[16]。Aligianis等[17]報(bào)道，RAB3GAP2基因的一個(gè)低倍純合剪切突變?cè)谝粋€(gè)家族中造成Martsolf綜合征。Borck等[18]報(bào)道，一個(gè)純合移框突變?cè)斐梢粋€(gè)土耳其女孩的Warburg Micro綜合征。IARS2(異亮氨酰-tRNA合成酶2)編碼蛋白可氨?；c其tRNA同源的氨基酸，氨酰合成酶被認(rèn)為是在進(jìn)化過(guò)程中最早出現(xiàn)的蛋白質(zhì)。在人中，與IARS2相關(guān)的疾病包括骨骼發(fā)育異常、生長(zhǎng)激素缺乏癥、白內(nèi)障和感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失等[19-20]。GO注釋表明，與該基因相關(guān)的生物學(xué)活動(dòng)包括核苷酸裝配和氨酰-tRNA編輯[21]。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，IARS2基因在人類中與多種疾病相關(guān)，如肥厚型心肌病[22]、非小細(xì)胞肺癌[23]、胃癌[24]等。H?gg等[25]利用全基因組基因薈萃分析認(rèn)為，IARS2等基因與歐洲人肥胖相關(guān)。Gomes等[26]發(fā)現(xiàn)，IARS2等蛋白質(zhì)合成和降解基因與內(nèi)洛爾牛的重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)。根據(jù)與這兩個(gè)基因相關(guān)的人疾病綜合征表現(xiàn)特征(骨骼發(fā)育，尤其是顱面部骨骼發(fā)育)，筆者推測(cè)，RAB3GAP2和IARS2基因可能參與調(diào)控玉山黑豬兩種頭型的形成過(guò)程。驗(yàn)證這一推測(cè)需要更多深入的后續(xù)研究，如精細(xì)定位和多組學(xué)聯(lián)合分析。

a.最顯著位點(diǎn)附近4 Mb的區(qū)域GWAS，四邊形塊代表不同顯著程度的SNP位點(diǎn)，不同顏色代表與最高點(diǎn)不同的連鎖不平衡程度；b. 290 kb置信區(qū)間內(nèi)的基因；c. 包含最高點(diǎn)的LD熱圖，最高點(diǎn)SNP用紅線表示，一段包含最高點(diǎn)的392 kb單倍型框用黑色線框圈出a. Regional plot of a 4 Mb region around the most significant SNP, diamonds represent the SNPs with differet significance, the colored diamonds indicate different linkage disequilibrium (LD) extents between the top SNP and other SNPs; b. Genes within the 290 kb confidence interval; c. LD heatmap for the SSC10 locus, the top SNP is indicated in red line, a haplotype block with 392 kb harbors containing the top SNP are highlighted by black triangles圖5 10號(hào)染色體上的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)Fig.5 The significant associated region on SSC10

4 結(jié) 論

本研究基于全基因組60K芯片數(shù)據(jù)，結(jié)合群體遺傳分化分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析，在SSC10上鑒別到了與玉山黑豬兩種頭型形成顯著關(guān)聯(lián)的遺傳位點(diǎn)。結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果和目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的基因功能，筆者推測(cè)，RAB3GAP2和IARS2是影響玉山黑豬頭型的重要候選基因。該結(jié)果為玉山黑豬及中國(guó)地方豬種群體內(nèi)不同頭型形成機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。