沈懿娟，周妮妮，張健淞，王美芬，李玉峰，姜 平

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,H.parasuis) 屬于巴氏桿菌科的一種革蘭陰性多形性桿菌，是Gl?sser病的病原體，主要引起豬的多種漿膜炎，如多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和腦膜炎[1]。迄今為止，除了不可分型株外，已經(jīng)鑒定了15種副豬嗜血桿菌血清型[2]。其中，1、5、10、12、13和14是強(qiáng)毒血清型，2、4、8和15是弱毒血清型，3、6、7、9和11被認(rèn)為是無(wú)毒血清型[3]。通過(guò)副豬嗜血桿菌不同血清型侵入豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞AOC-45發(fā)現(xiàn)，血清型1、2、4和5侵入細(xì)胞水平顯著高于血清型7、9、10和13型。據(jù)此可推測(cè)，細(xì)菌的毒力可能與其吸附和侵入細(xì)胞的能力有關(guān)[4]。然而，毒力與吸附/侵入之間的關(guān)系尚不清楚。

早期的科學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)副豬嗜血桿菌可以感染豬肺泡巨噬細(xì)胞并與細(xì)菌的毒力存在一定的相關(guān)性[5]。肺泡巨噬細(xì)胞作為先天免疫反應(yīng)的成員之一，參與機(jī)體對(duì)外源病原的清除[6]。副豬嗜血桿菌在上呼吸道最初定植之后，在豬感染的早期階段進(jìn)入肺[7]，并能夠被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬[5, 8]。3D4/21細(xì)胞作為豬肺泡巨噬細(xì)胞的一種傳代細(xì)胞系雖然對(duì)一些病原菌已失去部分或全部的吞噬能力，但仍能被細(xì)菌侵入和保留分泌細(xì)胞因子的功能[9]，因此，該細(xì)胞可以作為副豬嗜血桿菌的侵入模型。

TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)廣泛的生理過(guò)程以及病理過(guò)程(例如細(xì)胞內(nèi)鳥分枝桿菌復(fù)合物感染細(xì)胞等[10])。嗅鞘細(xì)胞(OECs)可以分泌抗炎細(xì)胞因子TGF-β1，通過(guò)整合素/MFG-E8信號(hào)通路增強(qiáng)OECs的吞噬活性[11]。甲型流感病毒(IAV)感染細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞TGF-β1表達(dá)升高，同時(shí)纖連蛋白(Fn)與α5整合素的表達(dá)也隨之增加，從而導(dǎo)致了嚴(yán)重的細(xì)菌繼發(fā)感染。Fn是由膠原、纖維蛋白原、纖連蛋白和層黏連蛋白組成的細(xì)胞外基質(zhì)之一。細(xì)胞外基質(zhì)可以與整合素相互作用，而整合素是可以影響細(xì)胞吸附、遷移、增殖和分化的大分子復(fù)雜混合物[12]。此外，細(xì)胞外基質(zhì)還可以識(shí)別微生物表面組分，例如與細(xì)菌細(xì)胞壁共價(jià)連接的黏性基質(zhì)分子[13]，而這些黏附因子均受到TGF-β1的調(diào)控[14]。

副豬嗜血桿菌病是當(dāng)前我國(guó)豬群常見(jiàn)的細(xì)菌繼發(fā)感染性疾病，故本研究期望通過(guò)副豬嗜血桿菌感染3D4/21細(xì)胞試驗(yàn)揭示免疫細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)與副豬嗜血桿菌感染的關(guān)系。本研究探討了豬肺泡巨噬細(xì)胞傳代細(xì)胞系3D4/21中TGF-β1調(diào)控Fn/α5整合素表達(dá)與副豬嗜血桿菌侵入的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑

巨噬細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(Macrophage-SFM)購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；Mouse/Rat/Porcine/Canine TGF-β1 ELISA試劑盒購(gòu)自安迪生物科技有限公司；Anti-Fibronectin購(gòu)自艾博抗貿(mào)易有限公司；Purified Mouse Anti-Human CD49e 購(gòu)自BD 生物科技公司；Alexa Fluor488結(jié)合的Affinipure山羊抗小鼠IgG購(gòu)自Proteintech生物公司。特定的小干擾RNA(siRNA)片段由吉瑪生物公司合成。

1.2 細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件

本研究中使用副豬嗜血桿菌血清標(biāo)準(zhǔn)型5型菌株。將細(xì)菌在胰蛋白胨大豆瓊脂和含有0.01%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和5%滅活牛血清的胰酪胨大豆肉湯(分別為TSA和TSB； OXOID)中37 ℃培養(yǎng)。在使用之前，細(xì)菌接種于TSB并在37 ℃搖床以200 r·min-1振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，過(guò)夜培養(yǎng)物按1∶100接種新鮮培養(yǎng)基，振蕩孵育直至OD600 nm≈0.6。

1.3 3D4/21細(xì)胞培養(yǎng)

將3D4/21細(xì)胞在37 ℃ 5% CO2的條件下培養(yǎng)，并用含有10%滅活胎牛血清(FBS，Invitrogen)，100 U·mL-1青霉素G(Invitrogen)，100 mg·mL-1鏈霉素(Invitrogen)和MEM非必需氨基酸(Invitrogen)的RPMI 1640(Invitrogen)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞在達(dá)到90%密度時(shí)進(jìn)行傳代。

1.4 吸附和侵入試驗(yàn)

按照已有實(shí)驗(yàn)方法修改[15]后進(jìn)行吸附和侵入試驗(yàn)。將3D4/21細(xì)胞(3×105個(gè)細(xì)胞·孔-1)接種24孔細(xì)胞板。感染前，每個(gè)孔用PBS洗滌去除抗生素，并用副豬嗜血桿菌以幾個(gè)感染劑量(10、100、200和400 MOI)感染。將細(xì)胞板以800×g離心10 min，并在37 ℃ 5% CO2的溫箱中孵育不同時(shí)間(吸附：0.5、1、2 h，或侵入：1、2、4 h)。用PBS洗滌5次除去非特異性附著的細(xì)菌。

在進(jìn)行吸附試驗(yàn)時(shí)，除去非特異性附著的細(xì)菌后，在細(xì)胞板中加入100 μL 0.025%胰蛋白酶，37 ℃ 孵育10 min。胰蛋白酶處理后刮取細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中，然后以12 000×g離心1 min。除去上清液，將沉淀重懸于等體積的PBS中。將重懸的液體連續(xù)稀釋，取100 μL不同濃度稀釋液在TSA平板上涂布均勻。平板在37 ℃孵育48 h后進(jìn)行細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)。

在進(jìn)行侵襲試驗(yàn)時(shí)，除去非特異性附著的細(xì)菌后向每個(gè)細(xì)胞孔中加入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基(包括100 U·mL-1青霉素G和0.25 mg·mL-1慶大霉素)，將細(xì)胞板孵育1 h以殺死細(xì)胞外副豬嗜血桿菌。將細(xì)胞板洗滌3次，如上所述收集細(xì)胞進(jìn)行涂板。

1.5 熒光定量PCR分析

應(yīng)用OMEGA公司的總RNA提取試劑盒分離細(xì)胞總RNA，應(yīng)用HiScript Q RT SuperMix(諾唯贊生物公司)從總RNA合成cDNA，應(yīng)用ABI 7300熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied 生物公司)進(jìn)行熒光定量PCR。使用2-△△Ct方法以β-actin作為內(nèi)參計(jì)算TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量[16]。TGF-β1序列從Sus_scrofa基因組(GenBank登錄號(hào)：397078)中獲得，參照該基因序列設(shè)計(jì)相關(guān)TGF-β1引物(引物購(gòu)自賽默飛世爾科技公司)(F: 5′-CGAGCCCTGGATACCAACTA-3′；R: 5′-AGGCTCCAGATGTAGGGACA-3′)建立SYBR-Green熒光定量PCR方法。

1.6 TGF-β1濃度測(cè)定

將3D4/21細(xì)胞(3×105個(gè)細(xì)胞·孔-1)接種到24孔細(xì)胞板中并在巨噬細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用優(yōu)化后的侵入條件應(yīng)用副豬嗜血桿菌感染，在12、24、36 h收集細(xì)胞上清液(每12 h收集上清液后，加入新培養(yǎng)基)并于-70 ℃保存。通過(guò)Mouse/Rat/Porcine/Canine TGF-β1 ELISA試劑盒測(cè)定上清液中TGF-β1的濃度，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線(根據(jù)說(shuō)明書計(jì)算)對(duì)上清中的TGF-β1進(jìn)行定量。

1.7 RNA干擾測(cè)定

靶向Fn和α5整合素的siRNA片段以及一個(gè)非特異性隨機(jī)片段由吉瑪生物公司合成。siRNA序列來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室前期研究[17]，將3D4/21細(xì)胞(6×105細(xì)胞·孔-1)接種到12孔細(xì)胞板中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約70%時(shí)，將其用Fn和α5整合素的siRNA片段(1.2 μg·孔-1)轉(zhuǎn)染。然后用胰蛋白酶消化細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)分析

將3D4/21細(xì)胞用胰蛋白酶消化，并在37 ℃與Fn和α5整合素特異性抗體孵育0.5 h。用PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次后將細(xì)胞重懸，并與Alexa Fluor 488-結(jié)合的Affinipure山羊抗小鼠IgG在37 ℃孵育0.5 h。用PBS洗滌細(xì)胞后重懸，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 副豬嗜血桿菌吸附和侵入條件的優(yōu)化

吸附和侵入試驗(yàn)(CFU計(jì)數(shù)結(jié)果)表明最佳吸附條件為400 MOI作用0.5 h。最佳侵入條件為200 MOI作用2 h(圖1)。

2.2 副豬嗜血菌感染提高TGF-β1的表達(dá)

在副豬嗜血桿菌感染的細(xì)胞中TGF-β1水平在12、24和36 h分別是未感染細(xì)胞的1.36、1.52和1.25倍(P<0.05)(圖2A)。這些數(shù)據(jù)表明副豬嗜血桿菌感染增加了TGF-β1的表達(dá)。與此結(jié)果相一致的是熒光定量PCR也顯示副豬嗜血桿菌感染增強(qiáng)了TGF-β1 mRNA的表達(dá)，且在36 h觀察到最高值(P<0.001)(圖2B)。

2.3 TGF-β1提高副豬嗜血桿菌侵入

為了證實(shí)TGF-β1在侵入中的作用，將重組TGF-β1預(yù)處理細(xì)胞24 h后用副豬嗜血桿菌感染。結(jié)果顯示TGF-β1可以顯著增加副豬嗜血桿菌對(duì)3D4/21細(xì)胞的侵入(P<0.05)(圖3)。

2.4 副豬嗜血桿菌和TGF-β1可增加3D4/21細(xì)胞α5整合素和Fn的表達(dá)

用副豬嗜血桿菌感染3D4/21細(xì)胞和用重組TGF-β1處理24 h后，用流式細(xì)胞儀分析Fn和α5整合素的表達(dá)。與對(duì)照組相比，TGF-β1處理增加了Fn(7.77%對(duì)9.85%)和α5整合素(91.0%對(duì)97.8%)的表達(dá)。重要的是，副豬嗜血桿菌感染也增加了Fn(7.77%對(duì)9.11%)和α5整合素(91.0%對(duì)93.1%)的表達(dá)(圖4)。

單因素方差分析，Dunnett多重比較檢驗(yàn), ***.P<0.001, *.P<0.05One-way ANOVA, Dunnett’s multiple comparison test, ***.P<0.001, *.P<0.05圖1 副豬嗜血桿菌吸附和侵入條件的優(yōu)化Fig.1 Optimized conditions for H. parasuis adherence and invasion

A圖：配對(duì)t檢驗(yàn), *.P<0.05；B圖：?jiǎn)我蛩胤讲罘治?，Dunnett多重比較檢驗(yàn), ***.P<0.001Fig.A: Paired t test, *.P<0.05; Fig.B:One-way ANOVA, Dunnett’s multiple comparison test, ***.P<0.001圖2 副豬嗜血菌感染提高TGF-β1的表達(dá)Fig.2 H. parasuis infection enhances the expression of TGF-β1 in 3D4/21 cells

2.5 Fn和α5整合素的表達(dá)促進(jìn)了3D4/21細(xì)胞的侵入

為了進(jìn)一步分析Fn和α5整合素的作用，應(yīng)用RNA干擾片段下調(diào)它們的表達(dá)水平。將siRNA干擾片段轉(zhuǎn)染3D4/21細(xì)胞后，顯著抑制Fn(7.66%vs4.49%)和α5整合素(12.3%vs5.48%)的表達(dá)(圖5)。

當(dāng)用靶向α5整合素的siRNA片段轉(zhuǎn)染3D4/21細(xì)胞時(shí)，副豬嗜血桿菌的吸附和侵入分別下降了8.3%和37.4%。當(dāng)用靶向Fn的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，副豬嗜血桿菌的吸附?jīng)]有降低，而侵入降低了15.9%(圖6)。

3 討 論

副豬嗜血桿菌可與上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用[17-19]。雖然巨噬細(xì)胞是抵御侵入病原體的第一道重要防線，但它們?cè)诟必i嗜血桿菌感染中的作用尚不清楚[20]。細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的吸附是定植和侵入細(xì)胞的重要步驟[20]，而且侵入與副豬嗜血桿菌的毒力有關(guān)[21]。我們的研究結(jié)果顯示，副豬嗜血桿菌對(duì)3D4/21細(xì)胞的最佳吸附條件為400 MOI作用0.5 h，而最佳侵入條件為 200 MOI作用2 h。這些結(jié)果表明豬傳代肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21細(xì)胞在體外能被副豬嗜血桿菌感染，而且初步證明3D4/21細(xì)胞在12 h可以完全將侵入其中的副豬嗜血桿菌清除(數(shù)據(jù)未提供)，故3D4/21細(xì)胞可以用作研究H.parasuis侵入細(xì)胞的模型。

TGF-β1的表達(dá)與多種疾病和繼發(fā)感染相關(guān)。在研究Group AStreptococcus(GAS)感染上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GAS誘導(dǎo)TGF-β1的產(chǎn)生，而TGF-β1上調(diào)Fn/α5整合素增強(qiáng)了GAS對(duì)上皮細(xì)胞的侵入[14]。

配對(duì)t檢驗(yàn), *.P<0.05Paired t test, *.P<0.05圖3 TGF-β1預(yù)處理3D4/21細(xì)胞后促進(jìn)了副豬嗜血桿菌的侵入Fig.3 Pretreatment of 3D4/21 cells with recombinant TGF-β1 increased the invasion of Haemophilus parasuis

圖4 副豬嗜血桿菌感染和TGF-β1處理可增加3D4/21細(xì)胞Fn和α5整合素的表達(dá)Fig.4 H. parasuis infection and TGF-β1 treatment increase expression of Fn and α5 integrin

圖5 siRNA干擾Fn和α5整合素的表達(dá)水平Fig.5 Expression of Fn and α5 integrin after RNA silencing

單因素方差分析，Dunnett多重比較檢驗(yàn), ***.P<0.001, **.P<0.01, *.P<0.05One-way ANOVA, Dunnett’s multiple comparison test, ***.P<0.001, **.P<0.01, *.P<0.05圖6 Fn和α5抑制副豬嗜血桿菌的侵入Fig.6 Expression of α5 integrin and Fn inhibits invasion by H. parasuis

TGF-β1的表達(dá)與IAV感染后引起細(xì)菌繼發(fā)感染也相關(guān)[22]。在我們的研究中，副豬嗜血桿菌感染能顯著提高TGF-β1的表達(dá)，并在36 h達(dá)到高峰，而用TGF-β1預(yù)處理3D4/21細(xì)胞顯著增加副豬嗜血桿菌的侵入。流式細(xì)胞結(jié)果證實(shí)H.parasuis感染和TGF-β1處理可以上調(diào)Fn/α5整合素表達(dá)，由此我們推測(cè)H.parasuis感染3D4/21細(xì)胞誘導(dǎo)TGF-β1產(chǎn)生，且TGF-β1上調(diào)Fn/α5整合素表達(dá)會(huì)顯著增強(qiáng)H.parasuis對(duì)3D4/21細(xì)胞的侵入。

為進(jìn)一步驗(yàn)證Fn和α5整合素與H.parasuis侵入的相關(guān)性。應(yīng)用針對(duì)α5和Fn的siRNA片段下調(diào)Fn和α5的表達(dá)，揭示Fn和α5整合素的表達(dá)水平與3D4/21細(xì)胞對(duì)副豬嗜血桿菌的侵入呈正相關(guān)，證實(shí)了TGF-β1表達(dá)可以調(diào)控副豬嗜血桿菌的侵入。然而，副豬嗜血桿菌對(duì)細(xì)胞的吸附與α5表達(dá)相關(guān)，但與Fn關(guān)聯(lián)較小。我們推測(cè)副豬嗜血桿菌吸附可能與除Fn以外的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)，該推測(cè)需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

H.parasuis對(duì)3D4/21細(xì)胞的侵入水平可能會(huì)影響機(jī)體的抵抗力，細(xì)菌侵入細(xì)胞后細(xì)菌和細(xì)胞的相互作用仍需要進(jìn)一步研究。H.parasuis感染后TGF-β1表達(dá)的增加提高了其對(duì)3D4/21細(xì)胞的侵入，有可能提高機(jī)體對(duì)細(xì)菌的清除水平，這可能是機(jī)體維持自身平衡的一個(gè)精巧調(diào)節(jié)機(jī)制。

4 結(jié) 論

TGF-β1和Fn/α5整合素的表達(dá)促進(jìn)了副豬嗜血桿菌對(duì)3D4/21細(xì)胞的侵入，并在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用。