劉慶羊，孫自強，趙鴻雁，宋瑞龍，顧建紅，劉宗平*

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州 225009； 2. 揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究院，揚州 225009；3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009； 4. 揚州大學(xué)教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，揚州 225009)

破骨細胞(osteoclasts，OCs)是具有骨吸收功能的多核巨細胞。它不僅參與生理性骨改建，而且在病理性骨吸收過程中也具有重要作用。當(dāng)OCs數(shù)量增加或活性增強，可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、炎癥性關(guān)節(jié)炎等代謝性骨病。骨保護素(osteoprotegerin，OPG)是由成骨細胞分泌，能抑制OCs的分化和OCs的活性[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，破骨細胞的骨吸收與自噬密切相關(guān)，DeSelm等[3]證明自噬相關(guān)蛋白Atg5、LC3等通過影響破骨細胞皺褶緣的形成和炎性物質(zhì)的分泌調(diào)控OCs的骨骼重吸收功能。但OPG對OCs自噬的作用機制尚未闡明。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，(0、20、40、80 ng·mL-1) OPG處理RAW264.7誘導(dǎo)的OCs 24 h后，OPG呈劑量依賴性地抑制OCs的形成和分化[4]，也有文獻報道，OPG可競爭性地結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF) 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)，抑制TRAIL誘導(dǎo)的細胞凋亡[5-6]。研究表明，凋亡和自噬在不同的情況下存在密切和復(fù)雜的關(guān)系[7]。饑餓、低氧、感染和氧化應(yīng)激等異常情況可誘導(dǎo)細胞發(fā)生死亡[8]。自噬一般被認為是細胞的自我保護機制，但自噬過度激活也會導(dǎo)致細胞死亡[9]。在OPG作用于OCs和 OCPs后，自噬對凋亡的調(diào)控機制尚不明確。本文以小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞誘導(dǎo)分化形成OCs和OCPs，研究OPG對OCs、OCPs自噬和凋亡的影響及自噬對細胞凋亡的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株

RAW264.7細胞株，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞庫(ATCC Number：TIB-71)。

1.2 主要儀器與試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱、超低溫冰箱(Thermo，USA)；DMI3000B倒置相差顯微鏡(Leica，Germany)；電泳儀(Bio-Rad，USA)；5810R型冷凍離心機(Eppendorf，Germany)；CyAn ADP7型流式細胞儀(Beckman Coulter，USA)；DMEM、α-MEM (Life Technologies，USA)；10%胎牛血清(Gibco，USA)，M-CSF、RANKL、OPG(Peprotech，USA)；氯喹(MedChemExpress，USA)；雷帕霉素(Sigma，USA)；兔抗L3B(Sigma，#L7543，USA)，兔抗Atg5(Cell Signaling，#12994s，USA)，兔抗Beclin-1(Cell Signaling，#3495s，USA)，兔抗β-actin(Cell Signaling，#4970L，USA)；Annexin V-FITC 熒光染色試劑盒(BD，USA)。

1.3 RAW264.7 細胞培養(yǎng)與處理

將液氮凍存的RAW264.7 細胞37 ℃水浴融化轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，加入7 mL DMEM培養(yǎng)液室溫1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，加入5 mL培養(yǎng)液輕輕重懸，轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、 5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h換液，繼續(xù)培養(yǎng)待RAW264.7細胞鋪滿細胞培養(yǎng)瓶底80%～90% 時傳代。RAW264.7培養(yǎng)至第5代，細胞重懸于α-MEM培養(yǎng)液(含10%FBS)，將細胞以2×104·mL-1的濃度接種到6孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入細胞因子M-CSF(25 ng·mL-1)和RANKL(30 ng·mL-1)，培養(yǎng)3～5 d，每2 d 更換培養(yǎng)液一次，并添加同樣濃度的細胞因子。

RAW264.7細胞誘導(dǎo)3或5 d后分化成OCPs或OCs，經(jīng)CQ(50 μmol·L-1) 預(yù)處理30 min，或RAP(5 μmol·L-1) 預(yù)處理1 h，添加OPG(80 ng·mL-1)作用細胞6 h，試驗分組：Con、OPG、CQ、CQ+OPG、RAP和RAP+OPG組。

1.4 Western blot檢測OCs和OCPs自噬相關(guān)蛋白的表達

取處理過的細胞，棄去培養(yǎng)基，4 ℃PBS清洗2次 (去除不貼壁的細胞)，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，置于冰上裂解30 min，收集裂解液，于超聲裂解20 s，冷凍離心機4 ℃ 1 200 r·min-1離心10 min，收集上清液。BCA蛋白濃度定量試劑盒測定各組蛋白濃度，并調(diào)整為一致濃度，按體積加入6× SDS-PAGE Loading Buffer(1∶5)，隔水煮沸10 min ，-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

取等量樣品加入凝膠泳道，初始階段恒壓90 V電泳，待蛋白抵達分離膠恒壓110 V電泳，電泳結(jié)束后，采用恒壓濕轉(zhuǎn)法將蛋白從SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件110 V恒壓90 min，(轉(zhuǎn)膜時間依據(jù)目的蛋白分子量的不同需適當(dāng)調(diào)整)，根據(jù)目的蛋白相對分子質(zhì)量大小剪裁PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉緩沖液室溫振蕩封閉2 h，加入含 5% BSA的TBST配制的一抗(1∶1 000)，4 ℃ 孵育過夜，回收一抗，TBST緩沖液洗滌PVDF膜6次(5 min·次-1)，辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，回收二抗，TBST緩沖液洗滌PVDF膜6次(5 min·次-1)，將PVDF膜與化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑混合液充分反應(yīng)，然后將膜置于化學(xué)發(fā)光圖像分析儀內(nèi)，拍攝照片。用Image Lab軟件計算灰度值。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測OPG對OCs和OCPs凋亡率的影響

參照Annexin V-PI雙染色試劑盒的說明進行細胞處理。收集上清，用0.25% 胰蛋白酶消化收集細胞，1 200 r·min-1，4 ℃離心5 min ，棄上清，加入1 mL PBS重懸細胞，1 200 r·min-1，4 ℃ 離心5 min ，棄上清，加100 μL Binding Buffer制備細胞懸液，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻，室溫避光反應(yīng)20～30 min，每5 min輕輕顛倒混勻，加入400 μL Binding Buffer緩沖液終止反應(yīng)，細胞懸液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾分裝到流式管，立即用流式細胞儀檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 OPG對OCs及OCPs自噬的影響

2.1.1 OPG對OCPs自噬水平的影響 RAW264.7細胞誘導(dǎo)3 d后，經(jīng)CQ或RAP預(yù)處理后，添加OPG(80 ng·mL-1)作用細胞6 h。Western blot結(jié)果顯示(圖1)，與Con相比，OPG組OCPs的Atg5和Beclin-1蛋白水平極顯著或顯著上調(diào)(P<0.01或P<0.05)，LC3-Ⅱ無顯著差異(P>0.05) ，CQ組和CQ+OPG組的LC3-Ⅱ、Atg5和Beclin-1蛋白水平極顯著或顯著上調(diào)(P<0.01 或P<0.05)，RAP和RAP+OPG組的LC3-Ⅱ、Atg5和Beclin-1水平極顯著上調(diào)(P<0.01)；與OPG組相比，CQ+OPG組的LC3-Ⅱ和Atg5水平極顯著上調(diào)(P<0.01)，RAP+OPG組的LC3-Ⅱ水平極顯著上調(diào)(P<0.01)。提示OPG處理促進OCPs發(fā)生自噬。

2.1.2 OPG對OCs自噬水平的影響 RAW264.7細胞誘導(dǎo)5 d后，經(jīng)CQ或RAP預(yù)處理后，添加OPG(80 ng·mL-1)作用細胞6 h。Western blot結(jié)果顯示(圖2)，與Con相比，OPG組OCs的 LC3-Ⅱ、Atg5和Beclin-1蛋白水平極顯著下調(diào)(P<0.01)，CQ和CQ+OPG組的LC3-Ⅱ蛋白極顯著上調(diào)(P<0.01)，Atg5和Beclin-1蛋白極顯著下調(diào)(P<0.01)，RAP和RAP+OPG組Atg5和Beclin-1蛋白極顯著下調(diào)(P<0.01)，RAP組LC3-Ⅱ蛋白極顯著上調(diào)(P<0.01)，RAP+OPG組LC3-Ⅱ無顯著差異(P>0.05)；與OPG組相比，CQ+OPG組的LC3-Ⅱ、Atg5和Beclin-1蛋白極顯著上調(diào)(P<0.01)， RAP+OPG組的LC3-Ⅱ顯著上調(diào)(P<0.05)， Atg5和Beclin-1蛋白極顯著下調(diào)(P<0.01)。 提示OPG抑制了OCs的自噬產(chǎn)生。

與對照組相比， * *.P<0.01，*.P<0.05；與OPG組相比，## .P<0.01* *. P<0.01, *. P<0.05 versus control; ##.P<0.01 versus OPG圖1 OPG對OCPs自噬水平的影響Fig.1 Effects of OPG on the autophagy in osteoclast precursors

與對照組相比， **.P<0.01；與OPG組相比，## .P<0.01，#.P<0.05**. P<0.01 versus control; ##. P<0.01, #. P<0.05 versus OPG圖2 OPG對OCs自噬水平的影響Fig.2 Effects of OPG on the autophagy in osteoclasts

2.2 OPG對OCs和OCPs凋亡的影響

2.2.1 OPG對OCPs凋亡的影響 RAW264.7細胞誘導(dǎo)3 d后，經(jīng)CQ或RAP預(yù)處理后，添加OPG(80 ng·mL-1)作用細胞6 h。流式細胞儀分析測定結(jié)果顯示(圖3)，與Con相比，OPG、RAP 和RAP+OPG組早期凋亡率極顯著上升(P<0.01)，CQ組和CQ+OPG組早期凋亡率無顯著差異(P>0.05)；較OPG組，CQ+OPG組早期凋亡率極顯著降低(P<0.01)，RAP+OPG 組早期凋亡率極顯著增強(P<0.01)。提示OPG能夠引起OCPs凋亡，抑制自噬對OCPs凋亡的影響不明顯，而促進自噬能夠?qū)е翺CPs凋亡。

與對照組相比， * *.P<0.01，*.P<0.05；與OPG組相比，# # .P<0.01* *. P<0.01, *. P<0.05 versus control; ##.P<0.01 versus OPG圖3 OPG對OCPs凋亡的影響Fig.3 Effects of OPG on the apoptotic ratio of osteoclast precursors

2.2.2 OPG對OCs凋亡的影響 RAW264.7細胞誘導(dǎo)5 d后，經(jīng)CQ或RAP預(yù)處理后，添加OPG(80 ng·mL-1)作用細胞6 h。流式細胞儀分析測定結(jié)果顯示(圖4)，與Con相比，OPG、CQ、CQ+OPG 、RAP和RAP+OPG組早期凋亡率極顯著下降(P<0.01)。提示OPG處理使OCs凋亡率下降，抑制和促進自噬都能顯著降低OCs的凋亡率。

與對照組相比， * *.P<0.01，*.P<0.05* *. P<0.01, *. P<0.05 versus control圖4 OPG對OCs凋亡的影響Fig.4 Effects of OPG on the apoptotic ratio of osteoclasts

3 討 論

OPG是一種分泌型糖蛋白，能夠抑制骨吸收、增加骨密度，它能夠與細胞核因子-κB 受體活化因子(RANK)競爭性地結(jié)合RANK配體(RANKL)，并抑制OCs的形成[10]。研究表明，OPG顯著提高小鼠骨髓誘導(dǎo)的OCs的自噬水平[11]，也能夠抑制鴨胚OCs分化并促進其凋亡[12]。本文利用小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7誘導(dǎo)分化形成OCPs和OCs，添加OPG處理，表明OPG能夠促進OCPs發(fā)生自噬和凋亡，抑制OCs發(fā)生自噬與凋亡。

自噬是真核細胞中一種自我清除的過程，通過溶酶體介導(dǎo)的降解通路，主要降解細胞內(nèi)多余或受損的蛋白及細胞器，而自噬過度激活會導(dǎo)致細胞死亡。研究表明，自噬相關(guān)基因LC3、Atg5、Beclin-1等在OCs分化過程中起到了重要的作用[13-14]。LC3有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種亞型，分別定位于前自噬體和自噬體膜表面，LC3-Ⅱ的表達量在某種程度上反映了細胞的自噬活性[15]。Beclin-1在自噬起始階段起到重要的作用，主要通過調(diào)節(jié)其他的自噬蛋白定位到前自噬體膜上[16]。在動物機體內(nèi)，OCs的數(shù)量受嚴(yán)格的控制，以維持骨骼形成和發(fā)育，防止骨吸收過度所致的病理性骨丟失[17]。研究發(fā)現(xiàn)，RAP影響骨骼生長的功能，減少OCs的數(shù)量，破壞長骨的生長發(fā)育[18-19]。RAP通過抑制 mTOR的活化促進自噬的發(fā)生，添加RAP使OCs活性下降[20-21]。CQ能夠提高溶酶體的pH，使溶酶體中的酸性水解酶失去活性，因此位于自噬體或自噬溶酶體膜上的 LC3不能被及時降解，繼而LC3蛋白表達升高。還有研究表明，CQ通過抑制自噬來阻止OCs的分化，起到治療骨質(zhì)疏松癥的作用[22]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)[23]，RAW264.7細胞培養(yǎng)1、3、5、7 d后，經(jīng)80 ng·mL-1的OPG處理24 h，結(jié)果顯示OPG對于分化早期的OCPs和分化中末期的OCs具有不同的調(diào)控作用，促進OCPs存活和黏附結(jié)構(gòu)形成，抑制OCs活性。本研究在OCs分化至第3、5天，CQ或RAP預(yù)處理后，加入80 ng·mL-1OPG處理6 h，發(fā)現(xiàn)OPG促進OCPs的自噬水平，而抑制OCs的自噬水平。以上研究結(jié)果證明OPG對于OCs分化不同階段的生物效應(yīng)有所差異，在OCPs的分化過程中自噬起著正向調(diào)控作用，促進OCPs的分化；OPG阻止OCs向末期階段分化，抑制OCs的活性，此時自噬主要發(fā)揮維持穩(wěn)態(tài)的作用。

細胞凋亡是維持細胞穩(wěn)態(tài)的另一種重要機制。發(fā)生凋亡時，細胞膜上的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)發(fā)生外翻與鈣磷脂結(jié)合蛋白結(jié)合，Annexin V利用一種對PS具有較高親和性的磷脂結(jié)合蛋白作為敏感探針，檢測PS的變化[24]。本課題組前期研究表明[25]，40 ng·mL-1OPG處理RAW264.7細胞誘導(dǎo)的OCs，能夠通過抑制OCs的分化過程而阻止細胞凋亡的發(fā)生。自噬與凋亡關(guān)系在不同的組織和細胞中存在較大差異，順鉑可以引起膀胱癌細胞T24發(fā)生自噬，并且促進自噬能促進順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡[26]；聯(lián)合應(yīng)用烏蘇酸與唑來膦酸，通過增強自噬與氧化應(yīng)激水平，促進烏蘇酸誘導(dǎo)的人成骨肉瘤細胞凋亡[27]。另外，饑餓誘導(dǎo)小鼠成骨細胞，前2 h自噬抑制凋亡，隨饑餓時間延長自噬保護作用逐漸降低，最終細胞發(fā)生凋亡[28]。本研究采用流式細胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測OPG對RAW264.7誘導(dǎo)的OCs和OCPs凋亡率的影響，結(jié)果顯示OPG促進OCPs凋亡，抑制OCs凋亡，此外，促進自噬能引起OCPs的凋亡，而抑制和促進自噬皆顯著抑制OCs的凋亡。

4 結(jié) 論

OPG促進OCPs發(fā)生自噬和凋亡，抑制自噬對OCPs凋亡的影響不明顯，而促進自噬能夠?qū)е翺CPs凋亡。此外，OPG抑制了OCs的自噬發(fā)生和凋亡，而抑制和促進自噬都能顯著降低OCs的凋亡率。OPG作為骨質(zhì)代謝、炎癥免疫調(diào)節(jié)以及細胞凋亡中的重要調(diào)節(jié)因子，通過干預(yù)自噬流對OCs和OCPs凋亡有相反的調(diào)控作用，這為骨質(zhì)疏松、骨硬化癥以及腫瘤等多種疾病的診斷、治療提供了新的思路。