王 琰，王旭初，盧 娜，王慧君

0 引言

少弱精子癥是引起男性不孕的主要原因之一[1]。隱睪、精索靜脈曲張、生殖道感染、內分泌疾病、免疫異常、遺傳疾病等是該病癥主要的誘因[2]，但仍然有70%以上的男性不育病因不明[3]，即使已知病因的不育中，其發(fā)病機制也尚未完全闡明[4]?，F(xiàn)階段以營養(yǎng)療法、激素治療、外科手術和抗感染輔助生殖技術等作為主要的治療方案，但均未達到理想的效果[5]。中醫(yī)對少弱精子癥的治療，生精功能的改善方面以辨證論治為原則，具有一定的療效[6]。雖然有報道，精液中精子的數(shù)量和活動精子的百分率與自然妊娠率有統(tǒng)計學意義的相關性[7]，但臨床仍有1/3的男性不育患者的精液常規(guī)分析結果正常或接近正常[8]。因此，依靠精液常規(guī)分析判斷男性生育能力具有局限性，對于具有此癥狀超過1年的患者應進行精子功能檢查，如：精子-透明質酸結合實驗，精子頂體酶活性定量，鈣離子誘發(fā)頂體反應，精子的氧化應激損傷，以及精子頂體內其他酶的活性(ACP、HYD、ACE)等指標，這些指標均與不育有關[9-11]。四子種王膠囊有補腎益氣、通脈化瘀、通腹將濁的功效。中醫(yī)將腎虛作為引起男性不育的一個重要原因，其中主要病因為腎精虧虛，腎陽不振。因此，對男性不育癥的主要治療方法為補腎益精。四子種王膠囊方中韭菜子、淫陽藿、肉蓯蓉、鹿角膠、覆盆子等均為補陽之品，其作用為固腎生精，益腎壯陽，另外還有補肝、滋陰養(yǎng)血、去風除濕等功效，有提高精子數(shù)量及質量、改善精子功能等功效，但作用機制尚不清楚。本文旨在研究四子種王膠囊在治療少弱精子癥患者中的作用機制及療效。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇我院2016年5月至2017年5月入院確診的126例不育癥患者，年齡22～31歲，患者已婚，均為正常性生活，除外女方不育原因者。入選標準[12]：婚后1年時間以上未采用避孕，正常性生活，女方正常生育力，采用3次以上標準精液分析，精子均顯示濃度低，a級精子活動率小于25%，a+b級精子活動率小于50%。患者具有較好的依從性，均知情同意(批號：2017073)。排除標準[13]：勃起功能障礙，射精障礙，無精子癥；泌尿生殖系統(tǒng)先天畸形，于近期服用影響精子活力和生精功能的藥物(抗癲癇、抗腫瘤藥物)；精子或染色體出現(xiàn)基因異常；存在精神疾病，或具有肝、腎、造血系統(tǒng)嚴重疾病，心血管疾病。排除生殖系統(tǒng)嚴重炎癥以及精索曲張等其他可能導致男性不育的疾病。

1.2 用藥方案 對照組常規(guī)西醫(yī)方案：進餐時口服左卡尼汀口服溶液(東北制藥，國藥準字H19990372) 10 ml/次，早晚各1次；葡萄糖酸鋅片(海南制藥廠有限公司，國藥準字H46020030)，1片/次，3次/d，治療3個月。觀察組治療方案：在常規(guī)西藥治療的基礎上，加四子種王膠囊(冀藥制字z20070043)，5粒/次，2次/d，連服3個月。四子種王膠囊藥物組成：淫羊霍18 g，韭子12 g，石斛9 g，菟絲子10 g，肉蓯蓉8 g，覆盆子8 g，桑寄生9 g，懷牛膝10 g，蠶蛾9 g，鹿角膠20 g，熟地12 g，枸杞子8 g，當歸15 g。

1.3 精子標本來源 患者禁欲3～5 d，用新潔爾滅消毒手及尿道口，手淫法將全部精液置于無菌塑料容器內，至37 ℃恒溫水浴箱中，孵育30 min，完全液化后，取20 μl稀釋于380 μl精子稀釋液中，高倍鏡下計數(shù)四角及中央5個方格內精子數(shù)，參考值：精子計數(shù)>20×109/L。顯微鏡下觀察精子密度、精子活動率和精子畸形率。依據(jù)WHO判斷精子活動度的標準[14]，精子活力分4級：a級精子活動良好，呈快速、活潑、直線向前運動；b級精子能活動，但方向不明確，呈快速或遲鈍直線或非直線向前運動；c級精子活動不良，原地打轉或旋轉，向前運動能力差；d級精子不活動。精子活動度分級標準：<20%，20%～40%，>40%。少精癥為精子密度<20×106/ml，>5×106/ml；弱精癥：活率<75%，a+b級精子活力<50%或a級精子活力<25%；少弱精子癥患者均低于以上標準。

1.4 精液ACP、HYD、ACE檢測 ACP活性檢測方法[15]：取1 ml精液，用Earle液洗滌2遍，500 r/min離心10 min，配成1×106精子/ml懸液置于37 ℃ 1 h使之獲能，加入1 mmol孕酮至終濃度10 μmol/L誘導頂體反應，1 h后，1 000 r/min離心1 min，取上清10 μl，利用磷酸苯二鈉法檢測ACP活性。

ACE、HYD檢測方法[16]：精液經1 000 r/min離心10 min，留下層沉淀物，經PBS清洗2次，最終將沉淀精子懸浮于PBS緩沖液中。利用改良的明膠底物膜片和改良透明質酸-明膠底物膜片，置于37 ℃恒溫孵箱，3 h后取出，干燥后，顯微鏡下觀察結果。均勻選取5～6個視野，觀察100個精子，通過判斷精子頭部是否出現(xiàn)暈環(huán)判斷ACE和HYD是否陽性。利用顯微鏡上的微尺檢測暈環(huán)直徑大小，以直徑大小判斷ACE和HYD活性強度。

1.5 ROS、MDA、SOD檢測方法 利用精子細胞氧化應激活性氧(ROS)魯米諾化學發(fā)光法定量檢測試劑盒檢測精子細胞中ROS水平，具體操作見產品說明書(GENMED精子細胞氧化應激活性氧魯米諾化學發(fā)光法定量檢測試劑盒，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)。利用精子細胞MDA和超氧化物歧化酶(SOD)含量比色法定量檢測試劑盒檢測MDA和SOD含量，其中MDA采用硫代巴比妥酸法檢測，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法檢測(南京建成生物研究所)。具體操作參照產品說明書。

2 結果

2.1 兩組精子密度比較 治療后，觀察組、對照組患者的精子密度均得到改善(P<0.05)，且觀察組高于對照組(P<0.05)；通過精子活率評估精子質量發(fā)現(xiàn)，兩組治療前差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，治療后，觀察組精子活率明顯高于對照組(P<0.01)。見表1。

2.2 兩組精子活動度及精子畸形率比較 治療前，兩組精子活動度和畸形率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后鏡檢觀察顯示，觀察組患者精子活動度增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 兩組患者ACP活性檢測結果 治療后，兩組患者ACP活性均達到了正常范圍，觀察組ACP活性高于對照組(P<0.05)。見表3。

2.4 兩組HYD、ACE陽性率及活動強度比較 治療前兩組HYD、ACE及活動度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后，觀察組HYD、ACE陽性率及HYD、ACE活性強度高于對照組(P<0.05)。見表3。

2.5 兩組氧化應激損傷指標比較 治療前，兩組氧化應激損傷相關指標(ROS、MDA、SOD等)比較差異無統(tǒng)計學意義；治療后，觀察組ROS、MDA水平明顯低于對照組(P<0.05)，SOD水平高于對照組(P<0.05)。見表4。

2.6 不良反應 治療期間，兩組患者均未出現(xiàn)明顯的不良反應。

表1 不同方案治療后精子密度比較

表2 治療后兩組精子活動度及精子畸形率比較

表3 兩組患者HYD、ACE陽性率及活性強度比較(n=63)

表4 兩組患者氧化應激指標比較(n=63)

3 討論

精子形態(tài)、密度、活率是受精過程中的重要參數(shù)[17]。精子形態(tài)有頭端染色致密濃縮的細胞核，細胞核周圍有一層很薄的細胞質。前端富含多種溶酶體酶，主要有頂體酶ACE、透明質酸酶HYD和酸性磷酸酶ACP。精漿ACP與精子密度、活動率及活力相關，精漿ACP活性可作為男性不育精子質量檢測的指標之一。而頂體酶ACE活性的不足可導致不育、臨床精子存活率低、死精癥以及嚴重的生殖系統(tǒng)感染，特別是解脲支原體感染可導致精子頂體酶活性低，目前，頂體酶活性定量是判斷男性精子功能和生育力強弱的重要評價指標之一[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組患者的各項生殖指標均優(yōu)于單純常規(guī)西醫(yī)治療組，提示四子種王膠囊在治療男性不育方面有較好的療效。其不僅提高了精子的濃度，還改善了精子的運動能力，推測四子種王膠囊可能通過改善睪丸供血或生殖內分泌，促進精子生成。

本研究顯示，觀察組精子內氧化應激損傷的改善程度優(yōu)于對照組。ROS是信號傳導中的重要媒介，能調節(jié)精子的獲能和頂體反應等正常生理過程[19]。SOD則為精漿中清除ROS的活性酶[20]，ROS的產生和清除存在一定的平衡，若平衡被打破，則產生一定的氧化應激損傷。維生素E能夠維持谷胱甘肽過氧化物酶活性，有利于MDA清除，改善SOD活性。四子種王膠囊的成分復雜，但整體明顯改善了氧化應激損傷，清除了過多的自由基，改善了體內的抗氧化能力，進而改善附屬性腺的分泌功能，提高精子的運動能力。有報道，ROS對精子的損傷是導致男性不育的重要病因[21-22]。正常情況下，一定程度受控的ROS在精子獲能、精子高活躍性運動以及頂體反應中起重要作用，當ROS產生超出了抗氧化系統(tǒng)的清除能力，則產生多種毒性作用，損傷生精功能[23]。因此，ROS以及與之平衡相關的SOD的平衡對維持正常的生理功能發(fā)揮重要作用。 綜上所述，補腎益精治療可以很好地改善少弱精子患者的生精功能，其能改善ROS、SOD等指標，改善的氧化還原環(huán)境可能有利于精子的發(fā)生和成熟。總之，四子種王膠囊在治療少弱精子癥患者的機制復雜多樣，其可能通過多種機制、多靶點改善精液質量，進而治療男性不育癥。