蔣書(shū)東，張興旺，方富貴，周偉娟，王登峰，朱 暉

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

胸腺屬于中樞免疫器官，是與T淋巴細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育以及成熟密切相關(guān)的重要場(chǎng)所。1961年澳大利亞免疫學(xué)家Miller[1]通過(guò)切除胸腺的經(jīng)典試驗(yàn)方法，首次證實(shí)了胸腺作為免疫器官在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的重要地位，對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫具有調(diào)節(jié)意義。有研究表明，機(jī)體胸腺功能是否完善可對(duì)性腺的發(fā)育以及性機(jī)能產(chǎn)生重要影響[2]。

在人[3]、牦牛[4]、鼠[5]以及豚鼠[6]胸腺上進(jìn)行的相關(guān)研究，證明了胸腺對(duì)年齡表現(xiàn)出高敏感性，包括組織形態(tài)學(xué)、基本結(jié)構(gòu)以及基礎(chǔ)功能與年齡所表現(xiàn)出的緊密關(guān)系。在已有研究的高等脊椎動(dòng)物，胸腺組織會(huì)出現(xiàn)增齡性退化現(xiàn)象[7]，所以胸腺的增齡性退化可作為脊椎動(dòng)物機(jī)體免疫衰老的指標(biāo)性變化之一[8]。盡管胸腺會(huì)顯著退化，但是功能性胸腺細(xì)胞不會(huì)因?yàn)殡S年齡增長(zhǎng)而完全喪失功能[9]。人胸腺研究表明，正常人機(jī)體在1歲前后，胸腺指數(shù)達(dá)到最大，青春期開(kāi)始發(fā)生生理性退化[3]，而類(lèi)似的試驗(yàn)結(jié)果在小鼠上也被證實(shí)，自初情期起，小鼠胸腺會(huì)出現(xiàn)生理性退化[5, 10]。

S100是胸腺樹(shù)突狀細(xì)胞的有效標(biāo)記蛋白，Caspase-3對(duì)胸腺的變化具有重要意義。近年來(lái)，有學(xué)者提出TP53和CASP-3等基因與胸腺細(xì)胞的凋亡可能存在密切關(guān)系[11]。目前，有關(guān)山羊胸腺的增齡性變化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，為此，本試驗(yàn)便從組織學(xué)觀察、蛋白標(biāo)記和相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化角度對(duì)山羊胸腺進(jìn)行研究和探討，以豐富胸腺基礎(chǔ)研究?jī)?nèi)容，為胸腺研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；S100一抗(ab52642)和Caspase-3一抗(ab4051)購(gòu)自Abcam；免疫組化試劑盒(SC-3945)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；RT試劑盒(PCR-311)、熒光定量PCR試劑盒(QPK-201)和Sybr GreenⅠ染料(P3377)均購(gòu)自中國(guó)上海Shinegene公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)羊只為安徽白山羊，購(gòu)自安徽渦陽(yáng)安欣羊場(chǎng)。試驗(yàn)用羊均為雌性山羊，共分為4個(gè)時(shí)期：幼齡期(7 d，(1.9±0.24) kg)，初情期前(3.5月齡，(9.9±0.39) kg)，初情期(5月齡，(18.9±0.43) kg)以及成年期(18月齡，(26.0±1.10) kg) ，每個(gè)時(shí)期各3只。在相同季節(jié)，相同時(shí)間點(diǎn)使用相同的方法進(jìn)行胸腺組織的采集工作。

1.2.2 樣本采集與處理 試羊采取側(cè)臥保定，陸眠寧麻醉，稱(chēng)量體重并記錄，頸動(dòng)脈放血處死，采集完整胸腺，量取胸腺長(zhǎng)度、重量以及最寬處的值并記錄。分別取相同頸段位置和胸段位置胸腺組織，浸泡于4%多聚甲醛溶液，冷藏于4 ℃固定。采集胸段最靠近心基部位置的胸腺部分，每只羊采取3份，剔除脂肪組織，焦碳酸二乙酯(DEPC)水沖洗，放入凍存管，保存于液氮中24 h，轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱。山羊胸腺為淡粉色，質(zhì)地柔軟，包被有強(qiáng)韌的結(jié)締組織被膜，形狀不規(guī)則，主要包括頸段和胸段，其頸段起源于頜下腺后方，沿氣管腹側(cè)向胸腔入口方向延伸，胸腺頸段分為左右兩支，在胸腔入口的連接處融合，胸腺胸段起始于胸腔入口處，后方懸于心包膜的上方，胸腺頸段狹而長(zhǎng)，胸段則寬而短。

1.2.3 H.E.染色與免疫組化 制作石蠟切片，進(jìn)行H.E.染色，觀察并采集圖片。

免疫組化：二甲苯脫蠟(2道)→梯度濃度乙醇脫水→沖洗→抗原修復(fù)→H2O2孵育→BSA孵育→一抗(S100為1∶200稀釋?zhuān)籆aspase-3為1∶100稀釋)→等量二抗→DAB顯色→蘇木精染色→脫水、脫蠟→封片→采集圖像。每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(10×100)拍照，通過(guò)Image-Pro Pluse軟件灰度分析計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 熒光定量PCR 采用Trizol法提取胸腺RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明進(jìn)行cDNA合成，以cDNA為模板，SYBR GreenⅠ為染料進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。qRT-PCR反應(yīng)體系：Nuclease-Free Water 3.5 μL；上、下游引物各0.5 μL； DNA模版3.0 μL；GoTaq?qPCR Master Mix 2×7.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃15 s(40個(gè)循環(huán))；收集熒光信號(hào)。GAPDH和β-actin為內(nèi)參基因，使用2-△△Ct法測(cè)算目的基因表達(dá)量。引物信息見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的引物序列、產(chǎn)物大小

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)”表示，通過(guò)SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，統(tǒng)計(jì)組間數(shù)據(jù)差異性，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 雌性安徽白山羊胸腺重量、長(zhǎng)度、指數(shù)、最寬值和胸/頸長(zhǎng)度比的變化

雌性山羊胸腺重從幼齡期～初情期顯著上升(P<0.05)，且在初情期達(dá)到最大，初情期～成年期，胸腺重顯著下降(P<0.05)(圖1A)。胸腺長(zhǎng)從幼齡期～初情期前顯著上升(P<0.05)，初情期前與初情期無(wú)顯著差異(P>0.05)，初情期～成年期，顯著下降(P<0.05)(圖1B)。胸腺指數(shù)和最寬處值從幼齡期～初情期前顯著上升(P<0.05)，初情期前～成年期顯著下降(P<0.05)(圖1C, D)。胸腺胸/頸段長(zhǎng)度比值從幼齡～初情期前顯著下降(P<0.05)，初情期前與初情期無(wú)顯著差異(P>0.05)， 初情期～成年期有回升趨勢(shì)(圖1E)。

不同年齡段比較，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Different letters indicate significant difference between different ages (P<0.05). The same as below圖1 不同年齡段山羊胸腺重(A)、長(zhǎng)度(B)、指數(shù)(C)、最寬值(D)和胸/頸長(zhǎng)度比(E)的變化Fig.1 The difference in weight(A), length(B), index(C), maximum width(D) and ratio of thoracic/cervical length (E)of goat thymus between different periods

2.2 雌性安徽白山羊胸腺組織結(jié)構(gòu)觀察

H.E.染色結(jié)果表明，被膜包被胸腺并深入組織內(nèi)部形成小葉間隔結(jié)締組織(小葉間隔)，把胸腺組織分隔為胸腺小葉，胸腺小葉功能區(qū)域可分為皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)，髓質(zhì)區(qū)與小葉中央?yún)^(qū)域被皮質(zhì)區(qū)包圍，髓質(zhì)區(qū)細(xì)胞密度小于皮質(zhì)區(qū)，較為松散，且髓質(zhì)區(qū)有散在的胸腺小體。

幼齡期頸段胸腺皮質(zhì)、髓質(zhì)無(wú)明顯分界，胸腺組分細(xì)胞排列緊密但胸腺小葉較為疏松，見(jiàn)有少量小的幼稚型胸腺小體(圖2a)。初情期前胸腺組分細(xì)胞排列緊密，胸腺小葉緊湊，髓質(zhì)區(qū)直徑較小，皮質(zhì)區(qū)厚度較大，皮髓質(zhì)界限明顯(圖2b1，b2)。初情期胸腺皮髓質(zhì)界限明顯，髓質(zhì)區(qū)域變大且有融合趨勢(shì)，皮質(zhì)區(qū)變薄，胸腺小葉較初情期前變得疏松(圖2c1，c2)，在成年期，胸腺皮質(zhì)薄，髓質(zhì)區(qū)出現(xiàn)大面積融合現(xiàn)象，胸腺小體大量增加，且組織內(nèi)出現(xiàn)空泡樣現(xiàn)象，為脂肪組織填充形成(圖2d)。胸段結(jié)果與頸段相似，但與頸段不同的是，初情期(圖2g1，g2)胸段胸腺皮髓質(zhì)界限明顯，單個(gè)胸腺小葉較初情期前小(圖2f1，f2)，且胸腺組分細(xì)胞和胸腺小葉排列均緊密，髓質(zhì)區(qū)域變大但融合趨勢(shì)不明顯(圖2h)。

2.3 S100和Caspase-3在雌性安徽白山羊胸腺中的分布

2.3.1 S100在胸腺頸段、胸段的分布 在胸腺頸段，幼齡期胸腺小葉中皮髓質(zhì)區(qū)分不明顯，S100陽(yáng)性細(xì)胞極少，且分布于胸腺小葉中央?yún)^(qū)域，邊緣區(qū)域未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞分布(圖3a)；在初情期前(圖3b1，b2)、初情期(圖3c)及成年期(圖3d)，S100標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞TDCs分布規(guī)律相一致，主要分布在胸腺髓質(zhì)區(qū)和皮髓質(zhì)交界區(qū)，在皮質(zhì)區(qū)和小葉間區(qū)域未見(jiàn)分布。在胸腺胸段，S100陽(yáng)性細(xì)胞分布規(guī)律與頸段相一致，幼齡期S100陽(yáng)性細(xì)胞極少，分布于胸腺小葉中央?yún)^(qū)域(圖3f)；在初情期前(圖3g1、g2)、初情期(圖3h)及成年期(圖3i)，S100陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在胸腺髓質(zhì)區(qū)和皮髓質(zhì)交界區(qū)，在皮質(zhì)區(qū)和小葉間區(qū)域未見(jiàn)分布。S100陽(yáng)性細(xì)胞顯示為棕色不規(guī)則形狀(箭頭指示處)，可聚集存在，也可散在分布。統(tǒng)計(jì)分析表明，幼齡期胸腺頸段和胸段S100陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均顯著低于對(duì)應(yīng)部位的其他時(shí)期(P<0.05)，而其他3個(gè)時(shí)期間陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)(表 2)。

不同年齡段比較，同列不同字母表示差異顯著(P<0.05);同列相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

Different letters in the same line indicate significant difference among different periods(P<0.05);The same letter indicate no significant difference among different periods.The same as below

2.3.2 Caspase-3在胸腺頸段、胸段的分布 Caspase-3在胸腺頸段和胸段上的分布特點(diǎn)相似。在頸段，幼齡期胸腺僅有少量Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞散在分布，無(wú)法明確區(qū)分髓質(zhì)和皮質(zhì)區(qū)域，但主要見(jiàn)于靠近胸腺小葉中央?yún)^(qū)域的位置(圖4a)；在初情期前(圖4b1，b2)、初情期(圖4c)和成年期(圖4d)頸段胸腺，皮髓質(zhì)區(qū)域區(qū)分明顯，在皮質(zhì)、髓質(zhì)及皮髓質(zhì)交界區(qū)域均有陽(yáng)性細(xì)胞廣泛分布，多為散在性分布，少見(jiàn)聚集性分布。在胸段，幼齡期胸腺靠近胸腺小葉中央?yún)^(qū)域的位置有少量Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞散在分布(圖4f)，在初情期前(圖4g1，g2)、初情期(圖4h)和成年期(圖4i)胸段胸腺，皮髓質(zhì)區(qū)域區(qū)分明顯，在皮質(zhì)、髓質(zhì)及皮髓質(zhì)交界區(qū)域均有陽(yáng)性細(xì)胞廣泛分布。Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞顯示為棕色圓形至橢圓形較為規(guī)則的形狀(箭頭指示處)，大小較S100陽(yáng)性細(xì)胞均一。頸段胸腺Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)表明，在初情期，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與初情期前無(wú)顯著差異(P>0.05)，但初情期前和初情期陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著大于幼齡期(P<0.05)；且在成年期，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著多于其他3個(gè)時(shí)期(P<0.05)(表3)。胸段胸腺Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)表明，自幼齡期到成年期，呈現(xiàn)顯著增多趨勢(shì)(P<0.05)(表3)。

2.4 雌性安徽白山羊胸腺相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

幼齡期～初情期前，胸腺CASP-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)且達(dá)到峰值，初情期轉(zhuǎn)錄水平較初情期前顯著降低(P<0.05)，而成年期轉(zhuǎn)錄水平與幼齡組和初情期均無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖5A)。幼齡期～初情期前，胸腺CASP-8 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)達(dá)到峰值，初情期轉(zhuǎn)錄水平較初情期前顯著降低(P<0.05)，在成年期，其轉(zhuǎn)錄水平與其他時(shí)期相比無(wú)顯著差異(P>0.05) (圖5B)。在所選取的4個(gè)時(shí)期，S100 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖5C)。幼齡期與初情期前TP53 mRNA轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著差異(P>0.05)，初情期與其他時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平均無(wú)顯著差異(P>0.05)，而成年期TP53 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他時(shí)期(P<0.05)，且表現(xiàn)出從幼齡期～成年期逐漸升高的趨勢(shì)(圖5D)。

3 討 論

本試驗(yàn)研究了山羊胸腺在增齡性變化中的特點(diǎn)。山羊胸腺為淡粉色非規(guī)則條狀柔軟組織。本研究與在小鼠[12]的研究有些許差異，小鼠小葉間隔極不發(fā)達(dá)甚至沒(méi)有，而山羊胸腺被膜和小葉間隔均致密且堅(jiān)韌。對(duì)胸腺重量、大小等的統(tǒng)計(jì)分析表明，胸腺重量在初情期達(dá)到最大，胸腺指數(shù)在初情期前達(dá)到峰值，說(shuō)明雌性山羊胸腺在初情期前達(dá)到胸腺/機(jī)體相對(duì)最大，到初情期達(dá)到物理重量最大，隨后呈現(xiàn)出重量顯著降低趨勢(shì)，這與在人胸腺研究中得到的人出生后一年胸腺指數(shù)達(dá)到最大，初情期開(kāi)始退化趨勢(shì)[13]的結(jié)論和在小鼠的研究結(jié)論[14]保持了相對(duì)一致性。胸腺最寬處長(zhǎng)度在初情期前達(dá)到最大，胸/頸段長(zhǎng)度比在初情期前和初情期達(dá)到最小，隨后有所回升，這組數(shù)據(jù)表明胸腺發(fā)生退化早期，胸段退化速度快于頸段，而后期則頸段退化更快。

S100蛋白被Shinzato等[17]證實(shí)可作為T(mén)DCs的有效蛋白標(biāo)記物，在從免疫組化結(jié)果可知，在胸腺頸段，S100主要分布在皮髓質(zhì)交界區(qū)域以及髓質(zhì)區(qū)域，胸腺胸段結(jié)果與此相似，這與在牦牛胸腺的研究[4]以及在小鼠[18]的研究相一致，但在小鼠的研究表明，S100陽(yáng)性的TDCs也少量存在于皮質(zhì)區(qū)域。對(duì)S100蛋白陽(yáng)性的TDCs進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，頸段和胸段結(jié)果相同，幼齡階段陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著低于初情期前、初情期以及成年期，但是后3個(gè)時(shí)期統(tǒng)計(jì)結(jié)果均無(wú)顯著差異。

a、f.幼齡期；b1、b2、g1和g2.初情期前；c、h.初情期；d、i.成年期；e、j.陰性對(duì)照。a～e.胸腺頸段；f～j.胸腺胸段。b1、g1標(biāo)尺=100 μm，a、b2、c、d、e、f、g2、h、i、j標(biāo)尺=10 μm。C.皮質(zhì)；M.髓質(zhì)。箭頭指示處為陽(yáng)性細(xì)胞a, f. Infancy; b1, b2, g1 and g2. Prepuberty; c, h. Puberty; d, i. Adulthood; e, j. Negative control. a-e. Cervical thymus; f-j. Thoracic thymus. b1, g1 bar=100 μm, a, b2, c, d, e, f, g2, h, i, j bar=10 μm. C. Cortex; M. Medulla. Arrows point to the positive cells圖4 Caspase-3在不同年齡段山羊胸腺頸段、胸段上的分布Fig.4 Distribution of Caspase-3 in cervical and thoracic of thymus of goat during different periods

Caspase-3蛋白在胸腺皮質(zhì)區(qū)、髓質(zhì)區(qū)以及皮髓質(zhì)交界區(qū)均有分布，除在胸腺頸段初情期前和初情期階段蛋白表達(dá)量差異不顯著外，其他各組間差異均顯著，且呈現(xiàn)明顯的隨年齡增長(zhǎng)而增多的趨勢(shì)；在胸腺胸段，幼齡期、初情期前、初情期以及成年期的蛋白表達(dá)量均差異顯著，同樣呈現(xiàn)隨年齡增長(zhǎng)而顯著增加的趨勢(shì)，這與在牦牛的研究相同[4]；此外，Resendes等[19]在豬上的研究發(fā)現(xiàn)，從6日齡～2.5月齡的豬胸腺也呈現(xiàn)增多趨勢(shì)，但是在5月齡時(shí)又出現(xiàn)下降趨勢(shì)；周瑞祥等[20]證實(shí)了大鼠胸腺存在完整細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，且Caspase-3在此通路起到重要作用，可引發(fā)細(xì)胞不可逆凋亡。

本研究檢測(cè)了S100、CASP-3、CASP-8和TP53 mRNA在胸腺的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明，S100 mRNA在4個(gè)時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平均無(wú)顯著差異；胸腺CASP-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在初情期前達(dá)到峰值；胸腺CASP-8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平同樣在初情期前達(dá)到峰值；胸腺TP53 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在成年期最高。綜合4個(gè)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果，筆者推測(cè)，CASP-3和CASP-8在初情期前山羊胸腺具有重要作用，可能對(duì)于胸腺發(fā)育過(guò)程中胸腺細(xì)胞更新以及退化早期過(guò)程具有調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)作用；CASP-8和TP53 mRNA在成年山羊胸腺的轉(zhuǎn)錄水平變化說(shuō)明其是胸腺增齡性變化重要因素，在增齡性退化過(guò)程中可能具有重要調(diào)節(jié)作用。

圖5 不同年齡階段雌性山羊胸腺相關(guān)基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 The level of relative gene mRNA in thymus of female goat during different periods

4 結(jié) 論

4.1雌性山羊胸腺自初情期開(kāi)始呈現(xiàn)增齡性退化現(xiàn)象。

4.2CASP-3和CASP-8可能參與胸腺的發(fā)育和細(xì)胞更新以及退化早期過(guò)程，而CASP-8和TP53對(duì)成年后的胸腺退化更具重要作用。

B,PE

[17] SHINZATO M,SHAMOTO M,HOSOKAWA S,et al.Differentiation of Langerhans cells from interdigitating cells using CD1a and S-100 protein antibodies[J].BiotechHistochem,1995,70(3):114-118.

[18] 孫 宇,陸江陽(yáng),王曉虹,等.小鼠胸腺樹(shù)突狀細(xì)胞的分布與形態(tài)學(xué)觀察[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2004,29(9):813-815.

SUN Y,LU J Y,WANG X H,et al.Observation of the morphology and the distribution of mouse thymus dendritic cells[J].MedicalJournalofChinesePeople’sLiberationArmy,2004,29(9):813-815. (in Chinese)

[19] RESENDES A R,MAJN,SEGALéS J,et al.Apoptosis in normal lymphoid organs from healthy normal,conventional pigs at different ages detected by TUNEL and cleaved caspase-3 immunohistochemistry in paraffin-embedded tissues[J].VetImmunolImmunopathol,2004,99(3-4):203-213.

[20] 周瑞祥,黃云梅,劉 卉,等.胸腺細(xì)胞凋亡的死亡信號(hào)表達(dá)[J].解剖學(xué)雜志,2006,29(2):171-173,212.

ZHOU R X,HUANG Y M,LIU H,et al.Expression of death signal pathway in thymocyte apoptosis[J].ChineseJournalofAnatomy,2006,29(2):171-173,212. (in Chinese)