楊曉　唐蔚　蔣益蘭

摘要：目的 觀察健脾消癌方對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)因子及人結(jié)腸癌HCT116細胞周期、凋亡的影響，探討其抗大腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用機制。方法 將對數(shù)生長期的HCT116細胞分為空白組、生理鹽水組、5-Fu組及健脾消癌方低、中、高劑量組，分別干預(yù)48 h，收集細胞，采用流式細胞術(shù)檢測細胞周期、凋亡，Western blot檢測細胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達，PCR檢測c-myc、cyclinD1 mRNA表達。結(jié)果 與空白組及生理鹽水組比較，健脾消癌方各劑量組HCT116細胞凋亡比例、G1期細胞比例增加，S期細胞比例降低，且其細胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達降低，c-myc、cyclinD1 mRNA表達降低，尤以健脾消癌方高劑量組明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 健脾消癌方可促進人結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡并將其細胞周期阻滯，其機制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：健脾消癌方；大腸癌；Wnt/β-catenin信號通路；細胞凋亡；細胞周期

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.015

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）06-0061-05

Effects of Jianpi Xiaoai Prescription on Cell Cycle and Apoptosis of Human Colon Cancer HCT116 Cells and Wnt/β-catenin Signaling Pathway Related Proteins

YANG Xiao1， TANG Wei2， JIANG Yi-lan2， TAO Zi-hao1， LIU Ke1， SONG Cheng3

1. Graduate School of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；

2. The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha 410006， China；

3. Hunan Cancer Hospital， The Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine，

Central South University， Changsha 410006， China

Abstract： Objective To study the effects of Jianpi Xiaoai Prescription on cell cycle and apoptosis of human colon cancer HCT116 cells and related factors of Wnt/β-catenin signaling pathway； To investigate its mechanisms of anti-metastasis and recurrence of colorectal cancer. Methods The logarithmic growth phase HCT116 cells were divided into blank group， saline group， 5-Fu group， and Jianpi Xiaoai Prescription low-， medium-， and high-dose groups. After intervention for 48 h， the cells were harvested， and the cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. The protein expression of β-catenin in the nucleus was detected by Western blot， and the expression of c-myc and cyclinD1 mRNA was detected by PCR. Results Compared with the blank group and saline group， the ratio of HCT116 cells apoptosis of Jianpi Xiaoai Prescription low-， medium-， and high-dose groups increased； the proportion of cells in phase G1 increased and the proportion of S cells decreased； the expression of β-catenin protein in the nucleus and the expression of c-myc， cyclinD1 mRNA decreased， especially in the Jianpi Xiaoai Prescription high-dose group， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Jianpi Xiaoai Prescription can promote apoptosis of human colon cancer HCT116 cells and block the cell cycle， and its mechanism may be related to regulating Wnt/β-catenin signaling pathway.

Keywords： Jianpi Xiaoai Prescription； colorectal cancer； Wnt/β-catenin signaling pathway； apoptosis； cell cycle

大腸癌（colorectal cancer，CRC）指發(fā)生于結(jié)腸及直腸的惡性腫瘤。近年來，隨著生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國CRC發(fā)病率急劇上升。目前，CRC的治療仍以外科手術(shù)為主，輔以化學藥物、放射、靶向藥物等治療，術(shù)后5年生存率約50%。近年來，本課題組運用中藥復(fù)方健脾消癌方治療結(jié)直腸癌患者已達1萬余人次，臨床療效較好[1-3]，但其作用機理尚不明確。研究表明，Wnt信號通路可通過影響細胞凋亡、增殖和分化等生命活動參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展[4]，大約90%結(jié)直腸癌患者存在Wnt信號通路的異常[5]。本實驗以人結(jié)腸癌HCT116細胞為實驗對象，研究健脾消癌方對CRC細胞凋亡及Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)因子的影響，探討其抗CRC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性健康Wistar大鼠15只，4～6周齡，體質(zhì)量（300±20）g，長沙斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號SCXK（湘）2016-0002，飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院動物房，溫濕度適宜，人工12 h晝/夜循環(huán)照明，灌胃前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 細胞

人結(jié)腸癌HCT116細胞，上海生物醫(yī)學工程研究所。

1.3 藥物

健脾消癌方（人參10 g，白術(shù)10 g，法半夏10 g，靈芝10 g，黃芪20 g，茯苓15 g，薏苡仁30 g，淫羊藿10 g，莪術(shù)10 g，白花蛇舌草30 g，半枝蓮30 g，蚤休10 g，麩炒枳殼8 g，郁金15 g，甘草6 g），飲片購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院門診中藥房。將上藥加入10倍量水浸泡1 h，煎制1 h，過濾，將濾液儲存，再加入8倍量水，煎煮1 h，過濾，合并2次濾液，濃縮至3 g原藥材/mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?-氟尿嘧啶（5-Fu），0.25 g/支，北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號01646346Y。

1.4 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），PBS緩沖液（杭州四季青），胎牛血清（FBS，杭州四季青），乙醇（上?；瘜W試劑有限公司），胰酶（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Tris（美國Sigma公司），SDS（美國Sigma公司），TEMED（美國Sigma公司），Tween-20（美國Sigma公司），RIPA裂解液（北京普利萊），蛋白酶抑制劑（德國Merck公司），兔β-catenin一抗（美國Proteintech公司），顯影液（中國Well Biology公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司），Trizol（美國Invitrogen公司），引物（上海生工生物有限公司）。臺式冷凍離心機（深圳黑馬TGL-18R），超凈工作臺（法國Jouan MSC12），搖床（江蘇其林貝爾TS-92），電泳儀（美國Bio rad公司，164-5050），電泳槽（北京六一儀器廠，DYCZ-24EN），轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器廠，DYCZ-40A），熒光定量PCR儀（美國Thermo公司，SPL0960），流式細胞儀（美國Bio-rad公司），高壓消毒鍋（長沙厚益深泰醫(yī)藥科技有限公司），電熱干烤箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

2 實驗方法

2.1 藥物血清制備

參照文獻[6]方法制備健脾消癌方藥物血清及生理鹽水對照血清。藥物血清組大鼠給藥量按人與大鼠等效劑量換算為10 g/kg，健脾消癌方高、中、低劑量組大鼠分別給予20、10、2.5 g原藥材/（kg·d）健脾消癌藥液灌胃，生理鹽水組大鼠給予15 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃，每日1次，灌胃前空腹12 h，連續(xù)15 d，于第15日最后1次灌胃后30 min，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，腹主動脈采血，3000 r/min離心30 min，吸取上清液即血清，合并同組血清，56 ℃水浴30 min滅活補體，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，無菌試管分裝并標記類別及日期，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌HCT116細胞，用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%～90%時予以胰蛋白酶消化、傳代，約2 d傳代1次。

2.3 分組及給藥

取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整濃度為1.5×105個/mL，取6孔板2塊，每孔加入上述細胞懸液2 mL，分別設(shè)為空白組、生理鹽水組、5-Fu組和健脾消癌方低、中、高劑量組，每組2孔。細胞鋪板完成后靜置12 h，換成含藥培養(yǎng)液?？瞻捉M：5%FBS+10%FBS+DMEM培養(yǎng)基；生理鹽水組：5%生理鹽水對照血清+10%FBS+DMEM培養(yǎng)基；5-Fu組：1 μg/mL 5-Fu+10%FBS+DMEM培養(yǎng)基；健脾消癌方低劑量組：5%低濃度藥物血清+10%FBS+DMEM培養(yǎng)基；健脾消癌方中劑量組：5%中濃度藥物血清+10%FBS+DMEM培養(yǎng)基；健脾消癌方高劑量組：5%高濃度藥物血清+10%FBS+DMEM培養(yǎng)基。放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.4 流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡

各組細胞給藥培養(yǎng)48 h后用不含EDTA的胰酶消化收集，PBS懸浮，2000 r/min離心5 min，洗滌細胞2次，收集約1×105～5×105個細胞，加500 μL Binding buffer懸浮細胞，再加5 μL Annexin V-FITC混勻后，加5 μL Propidium iodide，混勻，室溫避光，反應(yīng)5～15 min。1 h內(nèi)于流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡情況。

2.5 Western blot檢測細胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達

收集細胞，用冰預(yù)冷的PBS洗滌細胞，3000 r/min離心2 min，棄上清液。加300 μL CER試劑，反復(fù)吹打混勻，冰上裂解15 min，4 ℃、800 r/min離心5 min，棄上清液，加300 μL NER，重懸沉淀，4 ℃、4000 r/min離心5 min，棄上清，再次冰上裂解15 min，4 ℃、800 r/min離心5 min，棄上清液，加50～80 μL Suspension Buffer重懸沉淀，得核蛋白。經(jīng)電泳及轉(zhuǎn)膜后加入含5 g/100 mL脫脂奶粉的TBST，封閉60 min，加入β-catenin一抗（稀釋比例1∶200），4 ℃過夜，TBS-T洗3次后將稀釋的二抗（HRP標記，稀釋比例1∶4000）與膜共同孵育45～60 min。TBS-T洗3次后，采用化學發(fā)光試劑曝光顯影。

2.6 PCR檢測細胞c-myc、cyclinD1 mRNA表達

收集細胞，Trizol提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度，以組織總mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL：3 μL RNA，2 μL Random primer，5 μL無菌DEPC處理水，70 ℃加熱5 min，迅速插入碎冰中冷卻，再依次加入4 μL 5×Reaction buffer、4 μL dNTP、1 μL RNase inhibitor，37 ℃加熱5 min，再加入1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，42 ℃放置1.5 h，轉(zhuǎn)72 ℃反應(yīng)10 min，得cDNA。SYBR法檢測基因表達：實時定量PCR（每個樣本每個指標3個孔，共30 μL體系，每孔9 μL）。體系組成：Template 2 μL，Primer F（10 μmol/L）0.5 μL，Primer R（10 μmol/L）0.5 μL，PCR H2O 12 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 15 ?L。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，59 ℃ 50 s，共40個循環(huán)。在NCBI上搜索目的基因序列，運用primer5軟件設(shè)計引物，由上海生工合成引物。引物序列見表1。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性時，組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用方差分析，多重比較用LSD法；數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊時，用非參數(shù)檢驗中多個獨立樣本Kruskal-Wallis H檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 健脾消癌方藥物血清對HCT116細胞凋亡的影響

與空白組、生理鹽水組比較，健脾消癌方藥物血清干預(yù)后，HCT116細胞凋亡比例增加（P<0.01），且呈劑量依賴性。結(jié)果見表2、圖1。

4.2 健脾消癌方藥物血清對HCT116細胞周期的影響

與空白組、生理鹽水組比較，健脾消癌方藥物血清干預(yù)后，HCT116細胞G1期細胞比例增加、S期細胞比例降低（P<0.05，P<0.01），且呈劑量依賴性。結(jié)果見表3。

4.3 健脾消癌方藥物血清對HCT116細胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達的影響

與空白組、生理鹽水組比較，健脾消癌方中、高劑量組HCT116細胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達明顯降低，尤以健脾消癌方高劑量組明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結(jié)果見表4、圖2。

4.4 健脾消癌方藥物血清對HCT116細胞c-myc、cyclinD1 mRNA表達的影響

與空白組、生理鹽水組比較，健脾消癌方中、高劑量組c-myc mRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01），健脾消癌方高劑量組cyclinD1 mRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結(jié)果見表5。

5 討論

本課題組經(jīng)長期臨床實踐，認為虛、毒、瘀并存是結(jié)直腸癌的基本病機特點，并以“健脾益氣，化瘀解毒”為法創(chuàng)制了防治CRC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的經(jīng)驗方健脾消癌方。該方由人參、白術(shù)、靈芝、黃芪、茯苓、薏苡仁等組成，寒溫并用，攻補兼施，共奏健脾益氣、化瘀解毒之功。

Wnt信號在細胞內(nèi)有2條通路，即經(jīng)典Wnt/β-catenin通路和非經(jīng)典Wnt/β-catenin通路。β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路中的核心元件，在該信號通路中起關(guān)鍵作用。Wnt蛋白通過影響由結(jié)直腸腺瘤性息肉蛋白等組成的降解復(fù)合物的磷酸化作用調(diào)控胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的濃度變化，參與Wnt信號通路的激活。

Wnt/β-catenin下游靶基因眾多，至今已發(fā)現(xiàn)的就達30多種，其中包括細胞周期相關(guān)基因cyclin，原癌基因c-myc、Survivin等。而細胞周期蛋白cyclinD1的異常以及原癌基因c-myc的表達，可促進細胞過度增殖，抑制細胞凋亡[7]。

凋亡是導(dǎo)致細胞死亡的生理性調(diào)節(jié)過程。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞凋亡進程受阻有著密切聯(lián)系[8]。因此，可通過觀察藥物對腫瘤細胞凋亡的影響，研究藥物的潛在抗腫瘤機制。

本實驗結(jié)果顯示，與空白組及生理鹽水組比較，健脾消癌方各劑量組HCT116細胞凋亡比例增加、G1期細胞比例增加，S期細胞比例降低，且其細胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達降低，c-myc、cyclinD1 mRNA表達降低。提示健脾消癌方可促進HCT116細胞凋亡，且可將細胞阻滯于G1期，其機制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

參考文獻：

[1] 蔣益蘭，潘敏求，蔡美.健脾消癌飲配合化療拮抗結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移62例總結(jié)[J].湖南中醫(yī)雜志，2007，23（1）：1-3.

[2] 蔣益蘭，俞天俊，趙曄.健脾消癌方治療老年中晚期大腸癌臨床觀察[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（3）：94-96.

[3] 王容容，王其美，蔣益蘭，等.健脾消癌方聯(lián)合化療治療晚期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的臨床研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（5）：1732-1735.

[4] 王倩，張珊，封國生.Wnt經(jīng)典信號通路在結(jié)直腸癌中的研究進展[J].醫(yī)學綜述，2017，23（5）：907-911.

[5] MUZNY D M， BAINBRIDGE M N， CHANG K. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer[J]. Nature， 2012，487（7407）：330-337.

[6] 李儀奎.中藥血清藥理學實驗方法的若干問題[J].中藥新藥與臨床藥理，1999，10（2）：31-34.

[7] 張嘉美，趙寧，吳曉玲，等.Wnt/β-catenin信號通路對細胞凋亡和壞死的調(diào)控研究進展[J].中國細胞生物學學報，2015，37（9）：1309-1316.

[8] 尹麗穎，李鳳金，仲麗麗，等.遼東楤木葉總皂苷對人結(jié)腸癌HT-29細胞凋亡的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2017，24（6）：49-52.

（收稿日期：2017-11-03）

（修回日期：2017-12-10；編輯：華強）